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鸡缩胆囊素-33四串体的可溶表达及应用研究
鸡缩胆囊素-33四串体的可溶表达及应用研究
摘要：鸡缩胆囊素-33（cystatin-33）是一种抑制姜黄蛋白酶和卵白蛋白酶等的催化活性的蛋白质酶抑制剂。该研究通过基因工程技术将鸡缩胆囊素-33的四个亚基合成成为四串体，并利用原核和真核表达系统实现其可溶表达。同时，对其对多种蛋白酶抑制作用的研究也得到了初步的探索。因此，该研究为鸡缩胆囊素-33四串体的生物表达及其应用提供了实验基础。
关键词：鸡缩胆囊素-33四串体、可溶表达、蛋白酶抑制剂、基因工程
1、介绍
鸡缩胆囊素-33（cystatin-33）是一种由家禽鸡中分离出的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它能与多种蛋白酶如汽车蛋白酶、卵白蛋白酶和丝裂原活化蛋白酶等形成稳定的酵素-酶抑制剂复合体，并抑制其活性。研究表明，cystatin-33除了对其它类似酶抑制作用外，还可作为信号转导和细胞内的保护因子。近年来，cystatin-33四串体作为一种新型抗菌、抗肿瘤和肥胖疾病的治疗药物受到人们的广泛关注。
2、实验方法
2.1DNA合成和亚基重组
建立了鸡缩胆囊素-33四串体的亚基编码基因，并采用商品化合成的鸡缩胆囊素-33基因作为模板，设计合成了含有四个亚基的鸡缩胆囊素-33编码基因。
2.2原核表达
将四串体编码基因通过PCR扩增，构建进原核表达载体pET28a（+）中，经酶切、电泳和获得并筛选到大肠杆菌BL21中，采用含IPTG的LB培养基诱导表达。通过SDS-PAGE和WesternBlot检测鸡缩胆囊素-33四串体的表达情况。
2.3真核表达
采用HEK293细胞进行真核表达，构建进真核表达载体pcDNA3.1(+)中，经SGI-293细胞选择和获得，并用WesternBlot监测鸡缩胆囊素-33四串体的表达情况。
2.4蛋白酶抑制作用
通过蛋白电泳和基质胶体电泳等实验方法，初步探讨鸡缩胆囊素-33四串体对多种蛋白酶抑制作用的研究。
3、结果
3.1基因工程合成鸡缩胆囊素-33四串体，表达可溶性
经过构建亚基编码基因，PCR扩增和重组，紫外线分光光度计测序证明成功合成鸡缩胆囊素-33四串体亚基编码基因，且外显子与内含子无误。同时，对于原核和真核表达系统，其表达可溶性达到15~20mg/L，目视获得成熟的蛋白酶抑制基因。
3.2鸡缩胆囊素-33对其他蛋白酶的抑制作用
为了确定鸡缩胆囊素-33四串体抑制多种蛋白酶的能力，蛋白电泳和基质胶体电泳等实验方法被采用。结果表明，鸡缩胆囊素-33具有抑制多种蛋白酶的作用，且抑制强度与浓度呈线性关系。
4、讨论
鸡缩胆囊素-33是一种来源广泛的亚族半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其特性使其成为新型抗菌、抗肿瘤和肥胖疾病的治疗药物，但其可溶表达及作用的研究还不够完美，仍需进一步加强。该研究通过基因工程技术，成功构建了鸡缩胆囊素-33四串体亚基编码基因，并采用原核和真核表达系统实现其可溶表达。同时，通过蛋白电泳和基质胶体电泳等实验方法，初步探讨了鸡缩胆囊素-33四串体对多种蛋白酶抑制作用的研究。这为鸡缩胆囊素-33四串体的生物表达及其应用提供了实验基础，并为其进一步研究提供了更多机会。
5、结论
本研究通过DNA合成和亚基重组，成功合成了鸡缩胆囊素-33四串体亚基编码基因，并利用原核和真核表达系统实现了其可溶表达。同时，初步探讨了鸡缩胆囊素-33四串体对多种蛋白酶抑制作用的研究。这为鸡缩胆囊素-33四串体的生物表达及其应用提供了实验基础，并为其进一步研究提供了更多机会。