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影响免疫检测的因素有哪些影响免疫检测的因素有哪些影响免疫检测的因素有很多，包括缓冲液、封闭、抗体、清洗、检测底物等等。下面是yjbys小编为大家带来的影响免疫检测的因素的知识，欢迎阅读。影响免疫检测的因素有哪些1缓冲液最常用的两种缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris缓冲液(TBS)。调整配方中缓冲液组分的各种改良配方已见诸期刊。缓冲液的关键要求是它应有助于保持抗体的生物活性。因此，离子强度和pH值应相当接近生理状态。PBS的配方(磷酸盐总浓度10mM)适用于广泛的抗体和检测底物。在孵育过程中，装有膜的容器应轻轻摇动。缓冲液的量应足够，完全覆盖膜，使其在缓冲液中自由漂浮。如果不止一张印迹放在容器中，缓冲液容量不足会导致印迹膜粘在一起。这将影响孵育溶液的充分接触，导致各种假象，如背景高、信号弱和灵敏度不均匀等。封闭要获得有意义的结果，必须保证抗体只与感兴趣的蛋白质结合，而不与膜结合。利用惰性蛋白、非离子去污剂，或无蛋白的封闭剂来封闭膜上未被占据的位点，可减少抗体的非特异结合(NSB)。封闭剂与膜的亲和力应高于抗体。它应填满膜上未被占据的位点，但不会替换膜上的目标蛋白。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、吐温20去污剂的稀释液(0.05-0.1%)以及Blk试剂。封闭剂通常溶解在PBS或TBS中。与封闭相关的风险包括：选择不适当的封闭剂或过量封闭会替换或掩盖目标蛋白质。因此，封闭剂的正确选择对成功的免疫检测很关键。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白标记的抗体，因为牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特异性抗体对磷酸化蛋白进行检测分析时，如果采用粗蛋白制剂作为封闭剂，由于这些制剂中可能含有磷酸酶，而印迹上的磷酸化蛋白会被这些酶去磷酸化，就有可能会影响分析结果。研究表明，在封闭液中添加磷酸酶抑制剂可增强磷酸化特异性抗体的信号。此外，适用于一种抗原-抗体组合的封闭剂可能不适用于其他组合。封闭液被点样在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸润，并在TBS中平衡。随后在印迹上添加检测试剂，孵育5分钟，并曝光在X射线胶片上。暗斑的出现则表明封闭剂与检测试剂不兼容。如果在标准的Western印迹操作中用Immobilon-P转印膜来替代Immobilon-PSQ转印膜，那么封闭液可能不足以饱和膜表面。可能需要更多的清洗步骤来降低背景。抗体在封闭之后，印迹与一个或多个抗体孵育。第一个抗体与目标蛋白结合，而第二个抗体与第一个结合。第二个抗体结合有酶或染料，可用来指示蛋白的位置。尽管一抗能直接标记，但使用二抗有明显的优势。首先，不止一个二抗分子能够与单个一抗分子结合，形成信号扩增。其次，标记的二抗(酶-抗体结合物)可用于大量不同特异性的一抗，从而不再需要标记多个一抗。多克隆或单克隆的一抗都可使用。多克隆抗体通常是以抗血清或亲和纯化的抗体形式提供的。单克隆抗体是在腹水或组织培养液中表达的，可直接使用或进行亲和纯化。一定要记住，变性蛋白可能无法被天然抗原培育出的抗体所识别。在某些情况下，可能需要非变性凝胶来进行印迹。抗体以缓冲液和封闭液稀释，以避免与膜的非特异结合。抗体稀释液通常也包含痕量的吐温20或另一种去污剂，以防止抗体的非特异聚集。许多发表的化学发光操作需要在封闭液和抗体稀释液中添加0.1%(v/v)吐温20。我们必须认识到，高于0.05%(v/v)的浓度有可能从膜上洗掉一些印迹的蛋白质。提高吐温20去污剂的浓度通常会降低背景。一种更简单且更经济的策略是降低抗体的浓度，特别是二抗(详见图1)。抗体必须特异针对目的蛋白，不能与封闭液中的组分交叉反应，且应该是相对纯净的。其他蛋白质或聚集物形式的杂质会导致非特异性结合和背景增高。免疫检测是一种极其灵敏的方法。为了实现高的信噪比和最高的灵敏度，一抗和二抗的浓度应针对每种情况来优化。一般来说，高倍稀释一抗或降低凝胶上的蛋白上样量可减少非特异信号。高倍稀释酶标记的二抗可最大限度降低整体的高背景。一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。高灵敏度的试剂(检测到飞克级)与低灵敏度的试剂(检测到皮克级)相比，抗体用量可减少20倍。抗体浓度的优化取决于检测底物的例子如图13所示。在使用最灵敏的检测试剂时，过量的抗体导致高的.非特异性和整体背景增高(左上)。在这种情况下，将一抗稀释度从1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用没那么灵敏的检测试剂(中间和最下面一行)时，抗体需要更为浓缩，以产生相同的信号。清洗清洗印迹，从膜上去除未结合的抗体，它们可能导致高背景和检测不佳。通常使用吐温20的PBS或TBS稀释液(0.05%v/v)，特别是当抗体制剂是粗制的，或高浓度使用时。如前所述，浓缩的去污剂溶液可能导致感兴趣的蛋白质从膜上洗脱。对于高度纯化的抗体，往