一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109725154A(43)申请公布日2019.05.07(21)申请号201811166782.0(22)申请日2018.10.08(71)申请人杭州康知生物科技有限公司地址311100浙江省杭州市余杭区余杭经济开发区新颜路22号201G(72)发明人张乐之余铭恩胡祥叶王立童李丹吴滨(74)专利代理机构苏州中合知识产权代理事务所(普通合伙)32266代理人龙涛(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/533(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书1页说明书13页附图2页(54)发明名称一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法(57)摘要本发明涉及一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒和测定方法。试剂盒由荧光微球标记的IgG4单克隆抗体溶液和免疫层析试纸条组成，抗体溶液包含特殊浓度的荧光微球，荧光微球分别是时间分辨荧光微球和量子点荧光微球。免疫层析试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上依次设置检测T线和质控C线；T线上包被IgG4，C线上包被羊抗鼠IgG。本发明提供的测定方法，测定线性范围0.031～8g/L,线性相关系数为0.9987；灵敏度为0.0169g/L；精密度平均为CV<15％；准确度平均回收率为101.5％；与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关(r＝0.9814)。该方法检测IgG4需时短，检测结果准确，操作流程简单，无需大型仪器设备，适用于基层医院及大医院门、急诊检验科。CN109725154ACN109725154A权利要求书1/1页1.一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：包括免疫层析试纸条和荧光微球标记的IgG4单克隆抗体溶液，其中IgG4单克隆抗体溶液中包含荧光微球标记的IgG4单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜设置在硝酸纤维素膜和吸水垫之间，硝酸纤维素膜上依次设置检测T线和质控C线。3.根据权利要求2所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述T线上包被IgG4，C线上包被羊抗鼠IgG，T线上包被的IgG4和血液样本中的IgG4能够和荧光微球标记的IgG4单克隆抗体产生特异性竞争结合反应，羊抗鼠IgG与荧光微球标记的IgG4单克隆抗体能够产生抗原抗体特异性结合反应。4.根据权利要求1所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述荧光微球分别是时间分辨荧光微球或量子点荧光微球中的至少一种。5.根据权利要求1所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述IgG4单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：(1)以人IgG4为靶抗原，分析并选择人IgG4的铰链区为抗原表位，合成IgG4多肽并偶联BSA蛋白，作为免疫原；(2)将步骤(1)得到的免疫原免疫小鼠，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用多肽多轮筛选最终得到分泌IgG4单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用磁珠法纯化单克隆抗体。6.根据权利要求1所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：IgG4片段的多肽，其序列如下：GluSerLysTyrGlyProProCysProSerCysPro。7.根据权利要求1所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述荧光微球标记的IgG4单克隆抗体溶液制备方法包括以下步骤：(1)荧光微球加入硼酸缓冲液中，加入EDC，混匀，室温孵育10-30分钟；(2)离心，去上清，重悬后加入IgG4单克隆抗体，室温孵育1-2小时；(3)封闭1小时，离心，用微球保存液重悬并清洗，置2-8℃保存。8.根据权利要求1所述的IgG4荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：(1)采用三维点膜喷金仪，将IgG4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上，T线上包被IgG4，C线上包被羊抗鼠IgG；(2)在干燥箱中干燥后，将样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC粘性底板组装；(3)切割成试纸条，加干燥剂于常温下密封保存。9.一种采用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒进行IgG4荧光免疫层析测定方法，其特征在于：包括以下步骤；(1)将不同浓度的IgG4标准品与荧光微球标记的IgG4单克隆抗体溶液混合；(2)混合后取100ul滴加到免疫层析试纸条加样孔，15分钟后，通过使用干式免疫荧光分析仪读取检测结果；(3)根据荧光值绘制标准曲线，再将待测样品通过上述方法进行检测。2CN109725154A说明书1/13页一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法技术领域[00