一种制备新型溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112852757A(43)申请公布日2021.05.28(21)申请号202110140305.2(22)申请日2021.02.01(71)申请人南京大学地址210000江苏省南京市鼓楼区汉口路22号(72)发明人吴俊华魏继武张海林张永辉吴俊艺刘淑雯马丁(74)专利代理机构江苏银创律师事务所32242代理人何震花(51)Int.Cl.C12N7/01(2006.01)C12N5/10(2006.01)C12N15/861(2006.01)C12N15/47(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表16页附图6页(54)发明名称一种制备新型溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L的方法(57)摘要本发明涉及溶瘤病毒的制备领域，具体涉及一种类囊泡技术用于制备新型溶瘤病毒的方法。本发明公开了一种新方法：病毒Ad5sPVRCD137L感染能表达特定膜蛋白VSV‑G的细胞，然后利用离心挤压/剪切的方法将这些细胞通过膜孔从而形成囊泡，制造由类囊泡包裹的溶瘤病毒，类囊泡的外表面在制备过程中保留了细胞表面的膜蛋白VSV‑G。所制备的新型病毒可以通过膜蛋白VSV‑G实现重靶向，增加病毒的基因转导效率，而且能逃避抗病毒抗体的中和作用，还能提高病毒产量，病毒所表达的可溶性融合蛋白sPVRCD137L可以发挥阻断免疫检测点和活化免疫共刺激的双重功能。CN112852757ACN112852757A权利要求书1/1页1.一种离心挤压剪切的类囊泡技术用于制备新型溶瘤病毒EM/VSV‑GAd5sPVRCD137L的方法，其特征为步骤如下：(1)制备细胞外膜上镶嵌VSV‑G蛋白的293T细胞，我们将此细胞命名为293T‑VSV‑G细胞，所述VSV‑G蛋白的DNA序列如SEQIDNO:19所述，所述VSV‑G蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:20所述；(2)293T‑VSV‑G细胞过夜培养，然后向293T‑VSV‑G细胞接种腺病毒Ad5sPVRCD137L，继续培养，然后收集细胞；腺病毒Ad5sPVRCD137L可以表达可溶性蛋白sPVRCD137L，该蛋白的一端是可以结合TIGIT的PVR蛋白，另一端是可以结合CD137的CD137L蛋白；(3)使用培养基、PBS或者其他缓冲液重悬收集的感染腺病毒之后的293T‑VSV‑G细胞，将细胞悬液利用离心挤压剪切的方法挤压细胞剪切通过孔径为10μm、5μm、1μm的膜滤纸；(4)收集挤压后的病毒悬液，将病毒悬液加入带有15％、20％和40％碘克沙醇垫层的离心管中，100000×g离心一段时间，收集新型类囊泡病毒所在密度梯度带；(5)透析液透析去除杂质，获得新型类囊泡病毒。2.如权利要求1所述的一种类囊泡技术用于制备新型溶瘤病毒EM/VSV‑GAd5sPVRCD137L的方法，其特征为：所述可溶性蛋白sPVRCD137L的DNA序列如SEQIDNO:6所述，所述可溶性PVRCD137L的蛋白序列如SEQIDNO:1所述；所述制备的新型溶瘤病毒EM/VSV‑GAd5sPVRCD137L其内部为腺病毒Ad5sPVRCD137L，外面为类囊泡膜包裹层、且膜上有VSV‑G蛋白。3.如权利要求2所述的一种类囊泡技术用于制备新型溶瘤病毒EM/VSV‑GAd5sPVRCD137L的方法，其特征为：所述可以结合TIGIT的PVR蛋白，在与TIGIT结合之后能阻断PVR‑TIGIT免疫检测点通路；所述可以结合CD137的CD137L蛋白，在与CD137结合之后能活化CD137介导的免疫共刺激通路。2CN112852757A说明书1/10页一种制备新型溶瘤病毒EM/VSV‑GAd5sPVRCD137L的方法技术领域[0001]本发明涉及溶瘤病毒的制备领域，具体涉及一种离心挤压/剪切生产类囊泡技术用于制备新型溶瘤病毒EM/VSV‑GAd5sPVRCD137L的方法。背景技术[0002]癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，每年都有数百万的人死于癌症。许多数病人在诊断时已经处于中晚期从而失去外科手术治疗的机会，传统的放疗化疗，并没有给肿瘤带来突破性的进展，即使小分子靶向药物，也面临着短期内复发的巨大挑战。[0003]近十年来，抗肿瘤免疫治疗临床研究不断出现的令人振奋的结果，给肿瘤患者重新带来了希望。同时阻断免疫负性调控和激活共刺激通路是被证明为有效的治疗肿瘤的方法，至今已有多个免疫检查点阻断剂被批准为用于临床肿瘤治疗的药物。TIGIT(Tcellimmunoglobulinandimmunoreceptortyrosinebasedinhibitorymotif[ITIM]domain)是近年来发现的另外一个表