植物衰老生理.doc

装订线实验报告课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型：实验名称：植物衰老生理姓名：专业：学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：一、实验目的和要求二、实验内容和原理三、主要仪器设备四、操作方法与实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析七、讨论、心得实验目的和要求熟悉提取植物组织中蛋白质的一般办法掌握MDA、SOD测定的原理及方法掌握离心机、分光光度计等仪器的使用方法了解植物衰老过程中，物质含量的变化实验内容和原理材料：新老青菜叶片内容：植物组织蛋白质、丙二醛含量测定原理：蛋白质测定考马斯亮蓝G--250(Coomassiebrilliantblue，G-250)法是利用蛋白质--染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比Lowry法灵敏4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。2、丙二醛含量测定MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物。该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处，消光系数为155(mM)-1cm-13、SOD活性测定SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02-+02-+2H+H202+02四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收，而SOD能清除O2.-,抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率，可以表征出SOD含量。（但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液，做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件，使得该法实验数据重现性差；同时，在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD，也无法获得100%的对O2.-抑制率。为此，人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）主要仪器设备分光光度计、离心机、研钵、烧杯、移液枪、试管、离心管等操作方法与实验步骤蛋白含量的测定制备匀浆：称叶龄差异明显的叶片各0.5g，加入5.00ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。样品测定：取40ul蛋白提取液+160ul磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm波长下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯蓝溶液。MDA含量的测定取上清液1.0ml于7ml离心管中，加TBA与TCA混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92℃水浴保温30min。空白管：1mlPi-butter+TBA与TCA混合液4.0ml（92℃水浴保温30min）。冷却后平衡，离心5min；10000rpm。测定A532、A450和A600计算可溶性蛋白含量(ug/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg）*提取液体积/（测定加样量*鲜重）MDA（mM）=（A532-A600）/155/L（L为比色杯厚度（cm））蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA（uM）=6.45*（A532-A600）-0.56*A450SOD活性测定：1、称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5.00ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为酶提取液。2、取四支试管，分别在暗光条件下加入4mLNBBT反应液，取其中两支加入100uLPi-buffer，另两支加入100uL酶粗提取液，摇匀。加Pi-buffer的一支放在暗处做空白。其余三支在25℃光照（4000-10000lux）并计时，9min后取出观察颜色变化，9min后测560nmOD值。3、根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/g.FW）。一个酶单位相当于引起4mLNBT反应液达到50％抑制所需的酶量。测定时用空白调零。五、实验数据记录和处理：记录原始数据，相关计算公式及计算。可溶性蛋白：老叶新叶OD59