一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的荧光PCR检测引物组合物及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110951900A(43)申请公布日2020.04.03(21)申请号202010014735.5C12Q1/04(2006.01)(22)申请日2020.01.07C12R1/46(2006.01)C12R1/01(2006.01)(71)申请人河南科技大学地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路48号(72)发明人汪洋东笑靳曼玉易力王少辉毛晨龙李小康孙理云(74)专利代理机构洛阳公信知识产权事务所(普通合伙)41120代理人王海龙(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/06(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表2页附图2页(54)发明名称一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的荧光PCR检测引物组合物及方法(57)摘要本发明提供了一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的荧光PCR检测引物组合物及方法，能够同时有效的对猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌进行检测，引物组合物根据猪链球菌的gdh基因和猪支气管败血波氏杆菌的fla基因设计并且合成，同时实现对猪链球菌和猪支气管败血波士杆菌的定性及定量检测。本发明还通过灵敏度、重复性、特异性的检验表明该检测方法灵敏度高，特异性强，具有较好的重复性，同时本检测的方法还能实现实时监测，具有很高的可行性与应用前景，为病原微生物鉴定和降低养殖经济损失提供科学可靠的方法。CN110951900ACN110951900A权利要求书1/2页1.一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的荧光PCR检测引物组合物，其特征在于：引物组合物包括猪链球菌特异上游引物、猪链球菌特异下游引物、猪链球菌特异探针、猪支气管败血波氏杆菌特异上游引物、猪支气管败血波氏杆菌特异下游引物和猪支气管败血波氏杆菌特异探针，核苷酸序列分别为：猪链球菌特异上游引物Suis-gdhQF：5’-GTCATGGACTCGTGAAGAAGTAG-3’（SEQIDNO:1）；猪链球菌特异下游引物Suis-gdhQR：5’-GTAGTCTGTACCAAGGTCGTATTT-3’（SEQIDNO:2）；猪链球菌特异探针Suis-gdhQP：5’-X1-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-Y1-3’（SEQIDNO:3）；猪支气管败血波氏杆菌特异上游引物BBQF：5’-GGCTTCTTCAAACCGGGCAGCT-3’（SEQIDNO:4）；猪支气管败血波氏杆菌特异下游引物BBQR：5’-GTCGCAAACCTGCCGTAATCCAG-3’（SEQIDNO:5）；猪支气管败血波氏杆菌的特异探针BBQP：5’-X2-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-Y2-3’（SEQIDNO:6）。2.根据权利要求1所述的一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的荧光PCR检测引物组合物，其特征在于：探针序列5’端标记的荧光基团X1和X2分别为FAM、HEX、CY5、JOE、ROX中的一种，且X1、X2互不相同，探针序列3’端标记的淬灭基团Y1和Y2分别为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA中的一种。3.根据权利要求2所述的一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的荧光PCR检测引物组合物，其特征在于：猪链球菌特异探针Suis-gdhQP：5’-FAM-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-BHQ2-3’；猪支气管败血波氏杆菌特异探针BBQP：5’-CY5-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-BHQ2-3’。4.根据权利要求1所述的一种同时检测猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌的引物组合物的荧光PCR检测方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、计算猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌重组质粒标准样品的DNA拷贝数，将猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌标准样品分别稀释成108、107、106、105、104、103数量级拷贝数；步骤二、以步骤一得到的不同浓度的猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌基因组不同浓度的标准样品和提取的待测样品为模板，分别用权利要求1所述的引物Suis-gdhQF、Suis-gdhQR、BBQF和BBQR，及权利要求1或权利要求2所述的探针Suis-gdhQP和BBQP进行荧光定量PCR扩增反应；步骤三、根据荧光定量PCR扩增Cq值和反应荧光信号变化及强度，对待测样品中的猪链球菌和猪支气管败血波氏杆菌中的目标基因进行定性和定量分析。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤一和步骤二中，荧光定量PCR扩增反应体系包括：2×PremixExTaq(ProbeqPCR)10μL，引物Suis-gdhQ