一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106635946A(43)申请公布日2017.05.10(21)申请号201611250313.8C12R1/15(2006.01)(22)申请日2016.12.29(83)生物保藏信息CGMCCNo.134042016.11.30(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人王成胡丹刁刘洋毛贤军(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/77(2006.01)权利要求书1页说明书6页C12P13/14(2006.01)序列表2页附图1页(54)发明名称一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述谷氨酸棒杆菌，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。本发明所述谷氨酸棒杆菌解除了对谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰作用从而增加L-谷氨酰胺的产量，同时减少L-谷氨酰胺的分解，使培养基中L-谷氨酰胺的量增多，进而提高菌株发酵产L-谷氨酰胺的能力。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L-谷氨酰胺高产菌株，能有效积累L-谷氨酰胺，提高L-谷氨酰胺的产量，为L-谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础。CN106635946ACN106635946A权利要求书1/1页1.一种谷氨酸棒杆菌，其特征在于，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因表达同时降低或丧失。3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。4.根据权利要求1所述谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13404。5.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括：步骤A、分别构建glnE基因敲除重组载体和glsA基因敲除重组载体；步骤B、将glnE基因敲除重组载体转化谷酸棒杆菌MHZ-0512-1中获得重组菌株；步骤C、将glsA基因敲除重组载体转化步骤B获得的重组菌株即得。6.权利要求1-4任意一项所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产谷氨酰胺中的应用。7.一种L-谷氨酰胺的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.13404的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。8.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基由葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆30g/L组成，pH7.0。9.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述发酵培养基由葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO350g/L组成，pH7.0。10.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述发酵条件为33℃，发酵48h。2CN106635946A说明书1/6页一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用背景技术[0002]L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，学名为2-氨基-5-羧基戊酰胺，分子式为C5H10N2O3，分子量为146。L-谷氨酰胺是人体内氮源代谢过程中不可缺少的条件性必需氨基酸，对保持肌肉新陈代谢、细胞分化和生长、组织创伤的修复、体内毒素的中和有着重要作用。[0003]L-谷氨酰胺广泛存在于自然界，例如，以游离状态含于南瓜、向日葵的幼苗中。虽然可自天然产物提取谷氨酰胺，但L-Gln的生产方法主要有化学合成法、酶促合成法和发酵法。化学合成法是以L-Glu为原料,经过多步化学反应合成L-Gln。其中研究时间最长、技术条件最成熟的合成法主要有：L-Gln甲酯法(“手性源”合成法)和肼法。合成法的特点是使用化学试剂直接合成,方法直接且反应速度较快,但转化率不高且产品中反应物及副产物残+留是限制产品质量和使用范围。酶促合成法生产L-Gln是以NH4及谷氨酸作原料，经L-Gln合成酶(GS)催化而成。与化学合成法相比，酶促合成法反应步骤相对简单，其中三磷酸腺苷+(AT