蛋白质分离纯化主要方法专题培训课件.ppt

蛋白质分离纯化的一般步骤纯度鉴定
分子量测定定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。透析工作图2024/10/21二层析技术（chromatography）p148（一）、层析技术原理(二)层析相关概念
1.固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。2.流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。（三）、层析法分类（按分离原理分类）层析法分类（按装置分类）填充物各类层析的原理和载体原理：
以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。2024/10/21原理：物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：
色斑中心至原点中心的距离
Rf=──────────────
溶剂前缘至原点中心的距离凝胶层析（gelfiltration）
又称为凝胶排阻层析（gelexclusionchromatography）、分子筛层析（molecularsievechromatography）、
凝胶过滤（gelfiltration）、凝胶渗透层析（gelpermeationchromatography）等。原理p303载体
葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）
离子交换层析（ion-changechromatography）分类：
根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，
阳离子交换剂;
阴离子交换剂；
按其解离度的大小，
分为强、中强、弱三种：
磷酸基团（PO3H2）和亚磷酸基团（PO2H）2024/10/21交换过程2024/10/21应用
制备、纯化生物物质
定量、定性测定混合物中各组分原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。+2024/10/21应用分离纯化酶、抗原、抗体
分离纯化核酸
研究酶的结构与功能聚焦层析（Chromatofocusing）pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。
1、pH梯度的形成
2、蛋白质行为
3、聚焦效应层析时的聚焦效应示意图几种主要层析方法比较二、电泳技术电泳的一般原理电泳分类（二）按支持介质的不同可分为：1.纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳
3.琼脂凝胶电泳
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。（三）按支持介质形状不同
1.薄层电泳；
2.板电泳；
3.柱电泳。
（四）按用途不同可分为：1.分析电泳；
2.制备电泳；
3.定量免疫电泳；（五）按所用电压不同可分为：1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。
（六）按pH的连续性不同可分为：
1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳；
2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；电泳技术分类（按实验装置分类）毛细管电泳三、影响电泳的因素
（一）带电颗粒的物理性状
（二）支持物介质：
（三）缓冲溶液(pH离子强度)
（四）电场强度：
（五）电渗现象：
（六）焦耳热对电泳的影响四、常用电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamidegelelectrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。光聚合
催化剂是核黄素，核黄素