丙型肝炎实验室诊断技术研究进展.ppt

丙型肝炎实验室诊断技术研究进展丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。全球HCV的感染率约为3％，每年新发HCV病例约315万例，我国人群抗-HCV阳性率为3.2％，近4千万感染者。以长江为界，北方(3.6％)高于南方(2.9％)。目前尚无有效疫苗用以预防丙型肝炎。母婴传播率不超过6％。HCV是单链RNA病毒，包含约9600个碱基。HCV包含至少6种主要的基因型和大量的基因亚型。每种基因型的氨基酸顺序差异约为30％。按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b等)。基因型的分布存在地区差异。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。在我国大陆地区，以1b、2a型为主，输血途径感染者多为1b型，在欧洲和日本以1b型为主，中东地区以4型常见，6型主要见于香港和澳门地区。基因型的意义在于其与抗病毒治疗效果的相关性十分密切。
1.抗HCV抗体检测1.2胶体金法(PA)
原理：将胶体金结合HCV重组抗原固相于玻璃纤维上，待测样本中抗-HCV与之反应形成复合物，后者向上移动被固定于硝酸纤维素膜上的HCV抗原捕获，形成一条阳性色带，15min即可判断结果。
优点：该方法操作简单、无需特殊实验条件及仪器设备，灵敏度及特异性均较高，对丙型肝炎的早期发现及预防控制有重要参考价值。
1.3化学发光技术(CLIA)
是化学发光测定技术与特异性免疫反应相结合的一种检测方法，可行抗-HCV定性、定量检测，灵敏度、准确性较高，且可避免放射污染，临床应用趋于广泛。
②支链DNA(bDNA)技术：是一种不依赖PCR的核酸
放大定量方法。bDNA分支可结合RNA与包被于固相板上的探针杂交，固定后加入多个靶探针分别与HCVRNA5’非编码区和核心抗原区的不同位点杂交使信号放大数十倍，加入bDNA扩增后可与各靶探针结合，使每个核酸信号得以放大数百倍，通过底物发光检测。bDNA技术的优点是放大倍数确定、重复性好，可用于HCVRNA的动态变化研究，但其检测限高于RT-PCR方法。③转录介导的扩增术(TMA)：
特点是利用MMLV逆转录酶和T7RNA聚合酶2种酶的共同作用。优点为整个反应在一个试管中进行，显著减少了污染的可能。与RT-PCR比较定性检测低限更低。2．2HCVRNA基因型检测HCV可分为6种主要基因型
及11个主要亚型。
①限制性片段长度多态性方法(RFLP)：
是较早出现的分型方法，其利用RT-PCR扩增具有
不同酶切位点的各种HCV基因型，PCR产物被3～5种不同的限制性内切酶消化后，将电泳结果与已知限制性片段数据库比较确定其基因型。PCR-RFLP扩增的区域可以是5’UTR、核心区及NSSB。但RFLP由于其检测准确性低、成本高等原因，临床应用较少。②反相线性探针杂交法(Li-PA)：
基于反相杂交原理，通过生物素标记的引物扩增HCV5’UTR，产物变性后与硝酸纤维膜上基因型特异探针杂交，加入碱性磷酸酯酶和显色底物BT/BCIP后可显现紫色或棕色条带。该技术检测成本低，与金标准一致性很高，应用前景较好。③测序法：
原理是扩增HCV基因组种系信息区(NS5B、核心区或E1)并测序，将结果与已知基因型序列比较从而判断基因型，是HCV基因型检测的金标准。该法成本较高，临床应用较少，但在流行病学研究和亚型检测中能提供更全面的信息。④基因芯片技术：
基本原理是将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样本分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度获取样本分子的数量和序列信息。该技术应用广泛，可一次性对样品大量序列进行检测和分析，操作简单、自动化程度高。3HCV抗原检测4其他检测技术4.2环介导等温基因扩增技术(LAMP)
原理：在链置换型DNA聚合酶作用下启动链置换DNA合成，通过DNA合成延伸、链置换反应、扩增使整条链形成哑铃状结构，进而通过循环置换扩增实现对靶序列的放大。
优点：该方法与PCR比较反应时间缩短(1～2h即可完成)，无需特殊仪器、操作简单，应用前景较好。