植物转基因方法及特点和转基因沉默现象.pptx

会计学1植物的遗传转化方法及特点1．1基因枪法由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程，因此它具有不用原生质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因植株变异率低、通常具有正常的育性等优点[1]。特别是在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的应用。但是基因枪法也有自身的缺点：转化效率不高，大多在0.1~1.0%的范围内，难以选择；外源基因序列常是多拷贝插入，从而导致基因沉默；转入的基因有时是呈非孟德尔遗传；费用较高等[4]。1．2PEG法1．3显微注射法、电击法及激光法电击法（electroporation）是八十年代初发展起来的一种转化技术，首先在原生质体上运用此法将CAT基因（氯霉素乙酰转移酶基因）转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并得以表达[2]。此法的主要原理是在高压脉冲条件下，细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，籍此导入DNA等遗传物质，达到转化的目的。激光法同电击法类似，一定波长的激光聚焦后直径达0.3~0.5微米时，高能量的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔，短时间内又可自动修复，因而可利用激光束将外源DNA导入到细胞中。Weber等利用此法将荧光素酶基因导入油菜叶绿体中，Toper转化烟草、中国的傅荣昭等转化小麦均获得成功[2]。激光法和电击法均可用于双子叶和单子叶植物，转化受体材料广泛。但这种方法的效率低是显而易见的，使用范围小，存在问题较多，发展缓慢。1．4花粉管通道法1．5农杆菌介导法农杆菌Ti质粒的T—DNA中带有Onc基因（致癌基因），它在植物细胞内编码植物生长素和细胞分裂素，使受浸染的植物细胞不受限制地增殖而致瘤。此外T—DNA还编码Opine类化合物，作为农杆菌代谢地氮源和碳源。Ti上的T—DNA是由两端两个不完整的25个碱基对的顺向重复序列所界定，由于T—DNA不含编码促使自身转移物质的基因，故可将其上的Onc基因及其它不必要的序列去掉，而插入要转化的目的基因序列，从而达到既不致使植物致瘤而又能改良植物的目的[18]。农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点：操作简便不需特殊仪器，培养周期短；技术最成熟，转化效率高；外源基因多以单拷贝插入，稳定性好；可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达；较少出现基因沉默现象[3，18]；可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中等[10，14]。不过由于T—DNA可以在植物染色体的任何区域内插入，就有可能导致有益基因的插入失活，因此外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善[3]。特别是在禾本科粮食作物的遗传转化方面还存在许多局限[18]。2转基因植物中的基因沉默现象转基因植物的基因沉默总体分为两类：转录基因沉默（transcriptionalgenesilencingTGS）和转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencingPTGS）[21]。

基因沉默的方式分为顺式失活、反式失活和共抑制三种形式[15]。2．1植物转录基因沉默（TGS）植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（positioneffectvariegation）很相似[12]。植物中的甲基化可以象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传递进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝基因整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默，这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而导致的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活[5]。有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超甲基化）和染色质凝集（异染色质化）是与转录基因沉默相关联的普遍特征[11]。当基因导入一个并不连续的但具有沉默的同源序列的基因组时，活性的转基因也能失活和甲基化[15]，这种现象被称为“异位反式失活”（ectopictransinactivation），它能影响在相同启动子控制下的基因表达，即使是正在表达的编码序列也不例外[15]。这种特性表明启动子对这种转录沉默很关键，引发“异位反式失活”可能依赖于沉默位点通过指导DNA—DNA配对而干扰基因组其它位点，或者它可能涉及由沉默位点产生的可扩散传播的RNA起作用，这些RNA可通过RNA—DNA相互作用导致同源目标位点的基因沉默和甲基化[20]。2．2转录后基因沉默（PTGS）不过English等于1996年发现，并非所有的基因沉默体系中的转基因转录水平都是很高的[7]，表明还有其它一些因素起着引发基因沉默的作用。需要说明的是并非所有的转基因体系均发生PTGS，能够发生PTGS的转基因位