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鸭病毒性肝炎卵黄抗体检测方法的建立的中期报告
摘要：
本文采用具有高灵敏度和特异性的ELISA方法，建立了鸭病毒性肝炎（DUHE）卵黄抗体检测方法。通过对一系列条件的优化，建立了最佳的实验条件：抗原在1.0μg/ml的浓度下进行包被；1:100稀释的鸭血清进行检测；分离标记法检测，OD450值>0.38作为呈阳性标准。经验证，本检测方法对DUHE卵黄抗体具有较高的灵敏度与特异性，结果可靠。该方法成本低廉、操作简便、准确性高，具有推广应用的潜力。
关键词：
鸭病毒性肝炎；卵黄抗体；ELISA；检测方法
引言：
鸭病毒性肝炎（DUHE）是一种由鸭病毒性肝炎病毒感染引起的急性传染病，常在夏季发生流行，对鸭的生产和利润造成重大损失。DUHE的早期诊断及预防是预防鸭肝癌的重要措施之一。因此，鸭病毒性肝炎卵黄抗体检测具有极大的意义。ELISA检测方法灵敏度高、特异性强、操作简便，被广泛应用于病毒抗体检测中。本文旨在建立一种灵敏、专门的鸭病毒性肝炎卵黄抗体检测方法。
材料与方法：
（1）DUHE抗原
DUHE抗原经过离心沉淀和纯化，浓度为2.0mg/ml，保存在4℃下。
（2）样品与试剂
收集30个DUHE阳性鸭血清样品和30个DUHE阴性鸭血清样品，按1：1稀释，作为ELISA检测中的阳性和阴性对照物，GOATANTI-DUCKIgG-HRP作为检测试剂，试剂盒依据品牌说明书操作。
（3）实验步骤
i.将DUHE抗原在0.1M碳酸钠缓冲液（pH=9.6）中，以1.0μg/ml的浓度分别包被到96孔板的每一孔中，放置于4℃过夜，洗涤板孔3次，加入5%干奶粉洗涤缓冲液防止非特异性结合，放置于37℃、50min内使其形成包被状态。
ii.置于空气中干燥，然后加入1：100稀释的鸭血清样品（测试样品），每个孔50μl。孔数按试剂盒说明书进行。
iii.37℃下，在50min的时间内进行染色，洗涤三次，加入GOATANTI-DUCKIgG-HRP100μl，50min后洗涤三次，进行染色，洗涤4次。
iv.加入底物溶液，50min后，在490nm处检测吸光度。将吸收光度值以0.0mU/ml的DUHE特异抗体作为负对照，计算OD值。
v.分别采用包被含1.0、0.5、0.2、0.05、0.01μg/mlDUHE抗原的96孔板进行ELISA检测，以优化适宜荧光信号的抗原浓度。
vi.测试DUHE标准血清，以每个孔50μl稀释（以不同的控制区为负对照）进行ELISA检测。
结果：
（1）优化抗原包被浓度：根据实验结果，1.0μg/mlDUHE抗原包被效果最优；
（2）ELISA检测方法建立：1：100稀释的鸭血清样品，分离标记法，OD450值>0.38作为呈阳性标准；
（3）DUHE标准血清的ELISA检测结果：阳性率高达100%，与对照试剂盒的结果相一致。
讨论：
本文成功建立了一种灵敏、简单、专一的鸭病毒性肝炎卵黄抗体检测方法。该方法采用ELISA技术，操作简单、成本低廉、结果可靠，能够早期、准确地检测DUHE的卵黄抗体，为DUHE的早期诊断和预防提供了有效的手段。此外，本方法可应用于DUHE抗体的筛选、研究和应用中。