单细胞测序的建库方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110438572A(43)申请公布日2019.11.12(21)申请号201910868822.4(22)申请日2019.09.16(71)申请人上海其明信息技术有限公司地址201210上海市浦东新区张江高科技园区张江路665号907室(72)发明人孔培涛李奇陈亚庆杨圳蔡建飞(74)专利代理机构北京金信知识产权代理有限公司11225代理人李雪芹徐琳(51)Int.Cl.C40B50/06(2006.01)C12Q1/6869(2018.01)权利要求书1页说明书8页序列表73页(54)发明名称单细胞测序的建库方法(57)摘要本发明公开了一种单细胞测序的建库方法，其包括(a)对甲醛固定的细胞利用第一反转录引物进行细胞内反转录标记第一轮条形码(barcode)；(b)利用连接反应，使用第二轮引物和第三轮引物标记第二轮和第三轮barcode；(c)裂解生成子文库，模板转换后，利用PCR富集模板；(d)利用indexPCR标记第四轮barcode。本发明的建库方法采用固定的细胞或者细胞核作为实验材料，而不仅限于新鲜的样品，允许样品来源的复杂性，可以更为有效地利用样品。CN110438572ACN110438572A权利要求书1/1页1.单细胞测序的建库方法，其包括以下步骤：(a)对甲醛固定的细胞利用第一反转录引物进行细胞内反转录标记第一轮条形码(barcode)；(b)利用连接反应，使用第二轮引物和第三轮引物标记第二轮和第三轮barcode；(c)裂解生成子文库，模板转换后，利用PCR富集模板；(d)利用indexPCR标记第四轮barcode。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的所述细胞为多个细胞，所述多个细胞包括不同种类的细胞或不同组织来源的细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中，所述第一反转录引物按5’至3’依次包括5’引物合成磷酸化标记，用于和第二轮连接的linker序列的固定结构，用于区分细胞来源的作为barcode序列的可变结构，以及用于和mRNA的poly(A)尾进行特异性结合以保证反转录的特异性的固定结构。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一反转录引物包括SEQIDNO:1-96。5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中，所述第二轮引物按5’至3’依次包括5’引物合成磷酸化标记，用于和第三轮连接的linker序列的固定结构，用于区分细胞来源的作为barcode序列的可变结构，以及用于和第一轮连接的linker序列的固定结构。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二轮引物包括SEQIDNO:97-192。7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中，所述第三轮引物按5’至3’依次包括5’引物合成磷酸化标记，用于indexPCR反应的同时加上第四轮的固定结构，用于标记细胞内分子的固定结构，用于标记细胞的作为barcode序列的可变结构，以及用于和第二轮连接的linker序列的固定结构。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第三轮引物包括SEQIDNO:193-288。9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中，一个P5分别与P7-1～P7-8组成为一对引物，适配Illumina测序平台测序，对构建好的文库进行测序。2CN110438572A说明书1/8页单细胞测序的建库方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及单细胞测序领域，特别地，涉及一种基于细胞固定后进行单细胞建库的方法。背景技术[0002]在过去十年里，随着第二代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术和第三代测序(thirdgenerationsequencing,TGS)技术的飞速发展，引起生命科学领域的巨大变革。以往的研究，需要从大量细胞中获得足够多的核酸进行测序，因此测序结果往往表示的是细胞群体的表征，而单个细胞独有的细胞特性往往被忽略。为了解决上述局限性问题，单细胞测序技术应运而生。[0003]单细胞测序已经在肿瘤、发育生物学、神经科学等领域取得了丰富的成果。而单细胞的研究本可以更为迅速的扩大科学成果，但单细胞测序技术还存在着许多问题，比如需采用新鲜的细胞，样品利用率不高，昂贵的设备及相关试剂等，这对单细胞测序技术的研究和推广带来了很多不便，而对于单细胞生命科学研究的广泛开展也有诸多不利。因此优化开发新的单细胞测序技术，就显得刻不容缓。发明内容[0004]本发明的技术目的是提供一种单细胞测序的建库方法，它能够克服现有的单细胞测序技术中存在的缺点，如，受限于新鲜的细胞、需要定制化的相关仪器、细胞捕获率低以及样品处理操作复杂，该建库方法可以简化样品处理，提高细胞利用率，允许复杂的