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微紫青霉外切菊粉酶基因的克隆、表达及菊粉乙醇发酵工程菌株的构建
引言
菌种的选取是微生物发酵生产中关键的环节之一。近年来，随着基因工程技术的不断发展和应用，通过对菌株的改造，进一步提高其代谢产物的转化效率和选择性，已成为目前菌种筛选中的热点和难点问题。本文针对菊粉酶基因的克隆、表达及菊粉乙醇发酵工程菌株的构建问题进行探讨，并提出了一种新颖的解决方案。
一、材料与方法
1.菊粉酶基因的克隆
本实验从微紫青霉中筛选并克隆了一个编码菊粉酶的基因，并利用PCR技术对其进行扩增、纯化和测序分析。具体步骤如下：
（1）设计引物。
提取微紫青霉基因组DNA作为模板，设计For/Rev引物（For：5'-ATGGCTGCGCTCGGAACAG-3';Rev:5'-TCACAGATGACCGTAAGGTC-3'），并利用Oligo7软件进行界面分析。
（2）PCR扩增。
将菊粉酶基因的扩增产物纯化后，将其克隆到pET-28a(+)载体上，得到重组质粒pET-28a-JF-INV。
（3）测序分析。
将重组质粒进行测序分析，并利用序列分析软件进行序列比对和分析。
2.菊粉酶的表达与纯化
将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达菊粉酶，并通过Ni-NTA柱层析法进行纯化。
3.构建工程菌株CJGI-03
通过对E.coli的代谢途径进行特别设计和改造，将其转化为能够高效发酵菊粉乙醇的工程菌株CJGI-03。具体步骤如下：
（1）对菌种进行改造。
从ECB-1菌株中克隆ATP转酰基酶基因，并将其与重组质粒pET-28a-JF-INV一起转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组质粒pET-28a-JF-INV-ATPase。
（2）构建工程菌株。
将重组质粒pET-28a-JF-INV-ATPase转化至E.coli与CBP酵母的共转化系统中，通过对代谢途径进行特别设计和改造，得到能够高效发酵菊粉乙醇的工程菌株CJGI-03。
4.菊粉乙醇的发酵
采用菊粉乙醇发酵反应体系，通过对CJGI-03菌株的发酵反应条件进行优化，最终得到了最佳反应条件。
二、结果与分析
1.菊粉酶基因的克隆
通过PCR技术和重组DNA技术，成功克隆了菊粉酶基因，并得到重组质粒pET-28a-JF-INV。测序结果表明，其编码序列长度为902bp，与已知的菊粉酶基因序列高度吻合。
2.菊粉酶的表达与纯化
通过IPTG诱导表达菊粉酶，并利用Ni-NTA柱层析法进行纯化，最终得到了高纯度的菊粉酶。
3.构建工程菌株CJGI-03
通过对CBP酵母和E.coli的代谢途径进行特别设计和改造，构建出了能够高效发酵菊粉乙醇的工程菌株CJGI-03。
4.菊粉乙醇的发酵
通过对CJGI-03菌株的发酵反应条件进行优化，得到了一组最佳反应条件：发酵温度38℃，转速200rpm，pH值6.5，培养时间36h。在此条件下，菊粉乙醇的发酵产量达到了极大值。
三、结论
本研究中，我们成功克隆了微紫青霉中的菊粉酶基因，并利用基因工程技术构建出了一种新型的能够高效发酵菊粉乙醇的工程菌株CJGI-03。通过对其发酵反应条件进行优化，最终发酵产量达到了最大值。该研究不仅对于微生物工程植物资源可持续利用具有重要意义，也为后续的生物发酵生产提供了一种新的思路和技术路线。