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金银花chs、fls、chi基因全长克隆及序列分析
摘要
金银花是一种常见的中药材，其药效逐渐引起人们的关注。本研究的目的是克隆金银花的chs、fls、chi基因全长，并对其进行序列分析。本研究采用RT-PCR和RACE方法，成功克隆了金银花的chs、fls、chi基因全长。对其进行比对分析发现，金银花chs、fls、chi基因序列与其他植物中相应基因的序列高度保守，具有共同的进化起源和功能。本研究结果为深入理解金银花的生物学特性提供了重要的基础。
关键词：金银花；chs；fls；chi；克隆；序列分析
Abstract
HoneysuckleisacommontraditionalChinesemedicinalplantthathasgarneredincreasingattentionforitsmedicinalproperties.Theaimofthisstudywastoclonethefull-lengthchs,fls,andchigenesinhoneysuckleandanalyzetheirsequences.RT-PCRandRACEmethodswereusedtosuccessfullyclonethefull-lengthchs,fls,andchigenesinhoneysuckle.Sequencealignmentanalysisrevealedthatthechs,fls,andchigenesinhoneysucklearehighlyconservedwiththoseinotherplantspecies,indicatingacommonevolutionaryoriginandfunction.Theseresultsprovideanimportantfoundationforfurtherunderstandingthebiologicalcharacteristicsofhoneysuckle.
Keywords:honeysuckle;chs;fls;chi;cloning;sequenceanalysis
引言
金银花（LonicerajaponicaThunb.）是一种常见的中药材，其花和叶可入药，有清热解毒、解表散瘀、止血等功效，被广泛应用于中医临床治疗中。其中，黄酮类化合物是金银花的主要药效成分之一，包括咸蛇舌草素（quercetin）、芦丁（rutin）等。黄酮类化合物的生物合成途径中，chs、fls和chi分别是关键的酶。
近年来，基因工程技术的发展为探究金银花的生物合成机制提供了新的方法。但在开展这些研究之前，需要首先克隆金银花chs、fls、chi基因全长，并对其进行序列分析，以深入了解金银花的生物学特性。因此，本研究旨在采用RT-PCR和RACE方法，成功克隆金银花chs、fls、chi基因全长，并对其进行比对分析。
材料和方法
材料
金银花叶片样本，TRIzol总RNA提取试剂盒（Invitrogen）、PrimeScriptRT-PCR试剂盒（Takara）、ExTaqDNA聚合酶（Takara）、普通琼脂糖、载体pMD19-T等。
方法
总RNA提取和逆转录
将0.1g金银花叶片样本加入2mlTRIzol，混匀，离心10min。取上清转入新离心管，室温下加入0.5ml75%乙醇混匀，离心10min，弃去上清。用DEPC水洗涤沉淀物1-2次，空气干燥10min。用RNase-free水溶解沉淀物，加入逆转录试剂反应体系，按说明书进行逆转录。
PCR扩增
利用逆转录产物作为PCR反应模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性95℃5min，循环反应40次，每个循环包括：94℃30s，58℃30s，72℃1min，最终聚合72℃10min。PCR扩增产物检测：用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，观察目标基因片段是否存在。
克隆和测序
将PCR扩增产物纯化，连接pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，提取质粒DNA并进行测序。对测序结果进行序列比对和分析，并进行序列构建和系统发育分析。
结果
克隆和测序
本研究采用RT-PCR和RACE方法，成功克隆了金银花chs、fls、chi基因全长。克隆产物经过检测后，大小符合预期，并被测序验证。
序列比对和分析
对比对分析发现，金银花chs、fls、chi基因序列与其他植物中相应基因的序列高度保守，具有共同的进化起源和功能。经过构建系统发育树，并与已经鉴定的相关物种进行比较，可以更深入地了解所有物种之间的进化关系。
讨论
本研究成功克隆了金银花chs、fls、chi基因全长，并对其进行序列分析。对比对分析发现，金银花chs、fls、chi基因序列与其他植物中相应基因的序列高度保守，具有共同