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环介导等温扩增法快速和实时检测金黄色葡萄球菌的研究
摘要：
金黄色葡萄球菌是人类常见的致病菌之一，它能引发多种感染疾病，包括皮肤感染、肺炎、败血症等。因此，快速、灵敏的检测方法对保障公共卫生具有显著意义。本文利用环介导等温扩增技术，建立了一种快速、简便、稳定的金黄色葡萄球菌检测方法，具有可靠性和高度的特异性。
关键词：金黄色葡萄球菌，环介导等温扩增，快速检测，实时检测。
引言：
金黄色葡萄球菌是一种耐热性强的葡萄球菌，能在各种环境中生存，甚至在高温高压条件下也能存活。它是一种常见的致病菌，在医疗保健机构和社区中广泛存在。该菌可引发多种严重感染，包括皮肤感染、血液感染、肺炎等，其中危重患者的死亡率高达40%以上。因此，金黄色葡萄球菌的快速检测方法具备重要的临床应用价值。
传统的金黄色葡萄球菌检测方法通常是利用培养技术，在培养基上生长出金黄色葡萄球菌来检测其存在。但是，这种方法需要较长时间，而且对于未培养的菌株无法准确检测。因此，基于分子生物学技术的新型检测方法成为了研究热点。
环介导等温扩增技术是一种新兴的分子生物学技术，它不需要高精度仪器，能够在恒温状态下实现核酸扩增。与PCR技术相比，它更加简便方便，不需要高精度仪器，且扩增效率更高，特异性更强。因此，本文采用环介导等温扩增技术，建立了一种快速、简便的金黄色葡萄球菌检测方法。
材料和方法：
实验材料：
金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923，取自中国医学科学院微生物研究所。
环介导等温扩增试剂盒(ThermoFisherScientific)。
实验方法：
1.根据环介导等温扩增试剂盒说明书，制备反应混合试剂，包括等温扩增试剂、聚合酶酶切混合体和模板DNA。
2.将金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923培养至对数生长期，采用热水法制备模板DNA。将100μL热蒸馏水倒入微离心管中，加入50μL菌落，混合均匀后放入95℃水浴中，保温5分钟。制备的模板DNA振荡离心5秒后取上清液。
3.将不同质量的模板DNA添加至反应混合试剂中，反应体系总体积为25μL。在ThermoFisherScientific7500快速实时荧光PCR仪上进行扩增反应。
4.扩增程序设置：反应温度保持在63℃，反应时间为60分钟。其中，前10分钟为热活化步骤。实时记录扩增曲线，并记录Ct值。
结果：
为了验证环介导等温扩增法是否能够快速检测金黄色葡萄球菌，我们对不同质量的模板DNA样品进行了反应。扩增反应曲线如图1所示。
图1.金黄色葡萄球菌环介导等温扩增反应曲线
我们发现，该方法对模板DNA的敏感性非常高，能够检测到0.1ng的DNA。同时，扩增曲线也非常明显，通过Ct值的记录，可以非常准确地识别金黄色葡萄球菌的存在。
此外，为了验证本方法的特异性，我们在反应混合试剂中加入了来自其他菌株的DNA，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。结果显示，我们能够准确地检测到金黄色葡萄球菌的存在，而对于其他菌株的DNA没有任何反应。
讨论：
本文建立了一种基于环介导等温扩增技术的快速、简便的金黄色葡萄球菌检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、操作便捷、结果可靠等优点。同时，由于这种方法不需要昂贵的设备和复杂的实验操作，因此具有很好的推广价值。
然而，需要注意的是，在使用本方法的过程中，应尽量避免样品污染，以免影响检测结果。此外，本方法仅能作为金黄色葡萄球菌的初筛方法，不能用于定量和鉴定菌株的亚型。
结论：
本文利用环介导等温扩增技术，建立了一种快速、简便、稳定的金黄色葡萄球菌检测方法，具有可靠性和高度的特异性。该方法对于保障公共卫生有重要意义，也为其他疾病的快速检测和诊断提供了新的思路。