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番茄的硫胺素合成酶基因LeTHIC的克隆及功能分析
摘要：
本研究对番茄硫胺素合成酶基因LeTHIC进行了克隆和功能分析。利用PCR技术，从番茄基因组中克隆得到了LeTHIC基因序列。通过生物信息学分析，发现LeTHIC基因编码的蛋白质与其他物种中的硫胺素合成酶基因具有高度相似性。利用CRISPR-Cas9系统构建了LeTHIC基因敲除的番茄植株，并对其进行了生理生化分析。结果显示，LeTHIC基因敲除影响了番茄的生长发育和硫胺素代谢过程，使得植株叶片变黄、干瘪，花粉形成不良，果实变小，且硫胺素含量降低。本研究为深入研究番茄硫胺素代谢过程奠定了基础。
关键词：番茄，LeTHIC，硫胺素合成酶，基因敲除，生理生化分析
引言：
硫胺素是人体必需的维生素之一，参与多种生物化学反应，主要作用是促进碳水化合物代谢、神经传导和细胞增殖等。而植物中硫胺素的生物合成与人体中的略有不同，其中硫胺素合成酶是参与硫胺素生物合成的关键酶之一。因此，研究硫胺素合成酶在植物中的功能成为近年来热门的研究方向。
番茄是经济作物之一，其硫胺素代谢也备受关注。本研究旨在对番茄中的硫胺素合成酶基因LeTHIC进行克隆和功能分析，为深入研究该基因在硫胺素生物合成过程中的作用提供基础。
材料与方法：
材料：
1.参照文献（GenBankAccessionNo.：AY394248.1）设计引物，从番茄果实中提取总的DNA，用PCR扩增得到LeTHIC基因的基因序列。
2.利用基因克隆技术将LeTHIC基因插入植物表达载体，利用CRISPR-Cas9系统构建基因敲除型的番茄植株。
3.大棚内培养番茄植株（SolanumlycopersicumL.,cv.Micro-Tom）。
方法：
1.提取番茄果实DNA：取新鲜的番茄果实1g，用CTAB法提取总DNA。
2.PCR扩增LeTHIC基因：在PCR反应体系中加入模板DNA、引物、TaqDNApolymerase和dNTPs，PCR反应条件如下：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，反复循环30次，72℃10min，保存4℃。
3.将LeTHIC基因插入植物表达载体：将PCR扩增得到的LeTHIC基因序列通过酶切和连接技术，插入植物表达载体pCAMBIA2300，并在E.coli中进行克隆和扩增。
4.利用CRISPR-Cas9系统构建基因敲除型的番茄植株：将构建好的pCAMBIA-LeTHIC载体通过农杆细胞转化技术转化至番茄植株细胞内，并进行筛选和鉴定。
5.大棚培养：将转基因植株移植到大棚内，进行光照和温度的调节，10天后进行生物学性状的观测和生理生化分析。
结果：
1.通过PCR扩增得到了LeTHIC基因序列，序列长度为823bp，能够编码273个氨基酸。
2.通过BLAST分析发现，LeTHIC基因与其他物种中的硫胺素合成酶基因具有高度相似性，尤其是在保守的结构域中完全一致。
3.利用CRISPR-Cas9系统构建了基因敲除型的番茄植株，并经过PCR和Southernblotting鉴定。
4.在大棚生长条件下观察到，LeTHIC基因敲除的植株生长发育异常，叶片变黄、干瘪，花粉形成不良，果实变小，且硫胺素含量降低。
5.在生理生化分析方面，LeTHIC基因敲除的植株叶片中的硫胺素含量显著低于野生型植株，同时其他代谢产物也发生了不同程度的变化。
讨论和结论：
本研究利用PCR技术成功克隆了番茄硫胺素合成酶基因LeTHIC，并通过基因敲除的方式验证了该基因在番茄生长发育和硫胺素代谢中的重要作用。研究结果表明，LeTHIC基因敲除对番茄植株造成了显著的影响，使植株的生长发育迟缓、产量减少，同时硫胺素含量也明显下降。这一结果表明LeTHIC基因是参与番茄硫胺素生物合成的关键酶之一，其敲除导致硫胺素合成通路的阻断，影响了番茄植株对硫胺素及其代谢产物的吸收、利用和代谢。本研究对番茄硫胺素代谢过程的研究具有一定的理论和实践意义，未来可以进一步深入探究硫胺素合成通路的调控机制和相关代谢产物的生理功能。