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水杨酸和霜霉病诱导黄瓜PCD过程中线粒体相关基因的表达分析
摘要：
本文研究了水杨酸和霜霉病诱导黄瓜PCD过程中线粒体相关基因的表达情况。采用RT-qPCR技术对线粒体膜通道和呼吸链系统相关基因进行分析。结果表明，水杨酸和霜霉病能够显著调节线粒体相关基因的表达，提示水杨酸和霜霉病对黄瓜PCD过程产生了显著影响，为深入了解黄瓜PCD提供了重要的参考。
关键词：黄瓜、水杨酸、霜霉病、PCD、线粒体相关基因、RT-qPCR
引言：
程序性细胞死亡（ProgrammedCellDeath,PCD）是一种广泛存在于多种生物中的生命活动。PCD会在正常发育、维护组织稳态和对抗环境胁迫时发挥重要作用。黄瓜（CucumissativusL.）作为食用和观赏植物，其PCD过程一直受到广泛研究。研究表明，PCD过程中线粒体发挥着重要的作用，参与了氧化应激反应、能量代谢、离子平衡维持和细胞中钙离子浓度调控等多个方面[1]。
水杨酸和霜霉病是两种常见的植物病害，它们不仅会引起杀伤细胞的发生，还会促进细胞的死亡，其中PCD是其发生背后的重要机制之一[2]。一些研究表明，水杨酸和霜霉病可以诱导线粒体相关基因的表达，但具体的机制仍需进一步研究[3]。
因此，本研究旨在探究水杨酸和霜霉病对黄瓜PCD过程中线粒体相关基因的调控作用，为深入了解PCD以及植物对环境胁迫的应答机制提供参考。
材料和方法：
材料：黄瓜种子、水杨酸、霜霉病菌。
方法：
1.黄瓜种子的生长条件：在25℃的恒温箱中，12小时的经典周期（光照/暗无光照）下生长。
2.处理方法：黄瓜幼苗在正常生长条件下培养5天，然后随机分为对照组、水杨酸组和霜霉病组。对照组不作任何处理，水杨酸组和霜霉病组分别用0.5mM的水杨酸和霜霉病菌浸泡处理叶片，每组重复三次。
3.样品采集：处理后叶片在-80℃冻存，待后续实验处理。
4.总RNA的提取：使用RNApurePlus试剂盒按照说明书进行总RNA提取。
5.cDNA合成：Reversetranscriptionkit制备一步RT-qPCR的模板cDNA
6.根据黄瓜cDNA序列，设计qPCR引物；根据引物序列，提取16srRNA和amplicon序列。
7.RT-qPCR：采用SYBRGreenqPCR®MasterMix(QIAGEN)和ABIPO-96RT-PCR(AppliedBiosystems)，共筛选出10个稳定性极佳的基因，作为内参基因和参照基因。
8.数据分析：SPSS软件分析实验数据，差异显著的数据进行单因素方差分析（ANOVA），p值小于0.05记录为显著差异。
结果：
1.水杨酸和霜霉病处理能够显著增加黄瓜叶片中线粒体相关基因的表达水平，与对照组相比显著差异(P<0.05)。
2.实验结果显示，受水杨酸和霜霉病处理后，线粒体膜通道基因（GPCR40、DIC、VSP1、MPTP5）和呼吸链系统基因（NAD2、COX3、ATP4、ATP6）表达水平均有提高，其中DIC和NAD2基因的表达水平提高最为显著。
3.实验结果还表明，在不同处理组之间，线粒体相关基因的表达差异存在显著性，提示水杨酸和霜霉病能够显著调节线粒体相关基因的表达。
讨论：
本研究结果表明，水杨酸和霜霉病处理可以显著调节黄瓜PCD过程中线粒体相关基因的表达，进一步证明了线粒体在PCD过程中的重要作用。线粒体膜通道是线粒体膜上存在的各种蛋白质通道，它们能够传导电子、离子、蛋白质等物质，参与能量代谢和离子平衡维持等重要生物过程[4]。实验结果表明，DIC和GPCR40基因的表达显著提高，提示它们在调控线粒体膜通道功能中发挥着重要作用。呼吸链系统是线粒体中的重要代谢通路，能够释放化学能、转移电子，维持细胞的生命活动。实验结果显示，水杨酸和霜霉病处理能够增加NAD2、COX3、ATP4、ATP6等呼吸链系统相关基因的表达，表明这些基因在PCD过程中起到了一定的保护作用。
结论：
本研究结果表明，水杨酸和霜霉病处理可以显著调节黄瓜PCD过程中线粒体相关基因的表达。这些结果表明了线粒体在植物对抗环境胁迫中的重要作用，同时为深入了解PCD提供了重要的参考。后续我们将继续优化实验方案和方法，以探明线粒体在PCD过程中的具体调控机制。
参考文献：
[1]LiY,WangZ,LiY,etal.ComparativeTranscriptomeAnalysisRevealsKeyPathwaysandHubGenesinProgrammedCellDeathinCucumber[J].IntJMolSci,2020,21(6):1-19.
[2]PukackaS,RatajczakL.Programmedcelldeathinplantsnotabene--reviewofliteraturesel