大白菜BrSKS13基因在花粉发育中的功能鉴定.pptx

大白菜BrSKS13基因在花粉发育中的功能鉴定大白菜是异花授粉作物,杂种优势明显,杂交制种已成为国内外大白菜抗病、优质、稳产育种的首要措施。前期通过抑制差减杂交技术(SSH)在大白菜雄性不育两用系‘A02’中找到一段有显著性差异的基因片段,通过NCBI比对,发现与拟南芥SKS13(At3g13400)同源性最高,故命名为BrSKS13。
本研究通过qRT-PCR,原位杂交进行表达模式分析预测了BrSKS13的生物学功能;通过对拟南芥同源缺失突变体sks13花粉表型及花粉萌发等实验鉴定了该基因的功能;将BrSKS13基因转入拟南芥同源缺失突变体sks13,进一步验证功能恢复。主要结果如下:1.为了确定BrSKS13的时空表达模式,利用RT-PCR技术分析了它在大白菜可育株和不育株的根、茎、叶和花蕾中的表达情况,发现在可育株花蕾中有较高表达;又对该基因在可育花蕾的花瓣、花萼、花药和雌蕊中的表达情况进行分析,发现在花药中有较高表达;进一步分析该基因在花药六个等级中的表达情况,发现表达量随着花药等级的增加表现为上调。
表明BrSKS13是花蕾发育相关基因,可能参与花药的发育。应用qRT-PCR分析可育5级花蕾向不育株授粉0h,1h,2h,4h,8h,12h,16h和24h后的嫩角果,发现BrSKS13仍能持续表达,并且随着授粉时间的推移表达量先下降,当达到4h时,表达量迅速增加,而后又下降。
进而应用原位杂交技术对BrSKS13进行分析,在授粉后的柱头中能检测到该基因,表明该基因参与花粉管的生长。2.从TAIR网站上购买了拟南芥突变体sks13,采用“三引物法”鉴定出纯合突变体。
通过对纯合突变体表型的观察,发现与野生型拟南芥相比,突变植株在营养生长阶段与野生型没有明显的差异,当进入生殖生长阶段时,突变体植株略显矮小,抽薹数量比较少,说明SKS13的缺失可能影响了拟南芥某些生殖发育过程。通过观察纯合突变体花粉粒表型和花粉萌发实验,发现拟南芥SKS13的缺失会导致少数花粉发育不良,花粉不能正常萌发。
进而对突变体的结荚情况进行观察,发现与野生型相比,突变体的结荚率比较低,且角果长度较短,却略显粗壮,表明SKS13的缺失影响了拟南芥的正常结荚。3.利用构建的过表达载体,通过根癌农杆菌介导转化法,把BrSKS13基因转入拟南芥纯合突变体sks13中,并筛选出转基因植株。
BrSKS13基因在拟南芥中的表达模式分析可见,转BrSKS13的拟南芥在花药上出现GUS信号,说明BrSKS13与花药发育相关。对转基因植株,纯合突变体和野生型进行观察,发现转基因植株与突变体相比,抽薹数量增多、结荚数目增加、角果长度增长、花粉正常发育、种子数量增多等,而与野生型没有明显的差异。
这说明BrSKS13的插入可以使突变体的表型恢复。综上所述,BrSKS13可能参与了花粉发育和结荚等过程。