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质粒pBR_(322)电注入E.coliHB_(101)的研究
摘要
本文研究了质粒pBR322电注入大肠杆菌HB101的技术优化和转化效率。结果表明，采用0.1cm间距、2.5kV电压、10ms脉冲时间、室温静置5分钟的电注入条件可以得到较高的转化效率。同时，研究了不同浓度DNA对转化效率的影响，发现在一定范围内DNA浓度越高转化效率越高，但当DNA浓度超过一定程度后，效率反而下降。最后，通过对转化菌落PCR验证和酶切分析，证实了质粒成功转化至大肠杆菌中。
关键词：电注入；pBR322；大肠杆菌；转化效率
引言
质粒电注入是最常用的质粒导入大肠杆菌的方法之一，在分子生物学和遗传工程研究中起着重要作用。其基本原理是利用电场将质粒DNA导入细胞内。相较于其他质粒导入方法，如化学转化、热激转化和溶菌酶法，电注入具备快速、高效、简单等优势。然而，转化效率的高低和成败仍然取决于操作条件的优化。
本文研究了质粒pBR322（如图1所示）电注入大肠杆菌HB101的技术优化和转化效率，并对一些关键因素进行了探究。
材料与方法
材料
（1）质粒pBR322（ShanghaiShenggongBioengineeringCo.,Ltd.）
（2）大肠杆菌HB101（ShanghaiShenggongBioengineeringCo.,Ltd.）
（3）Luria-Bertani（LB）培养基
（4）DNase/RNase-free水（TIANGENBiotech）
（5）酚/氯仿提取仪（IMPLENGmbH）
（6）琼脂糖（TIANGENBiotech）
（7）TAE缓冲液（TIANGENBiotech）
（8）DNA电泳仪（Bio-Rad）
（9）电注入仪（Bio-Rad）
方法
（1）质粒DNA制备
将质粒pBR322转入大肠杆菌DH5α，经PCR扩增扫描所需的长度，然后酚/氯仿提取，最后用DNase/RNase-free水溶解并保存。选取不同浓度的DNA用于后续的电注入实验。
（2）大肠杆菌预处理
将大肠杆菌HB101在37℃下生长到对数生长期，由此取1mL菌液，离心10分钟，去除上清液，加入0.5mL冷蒸馏水，在4℃下静置5分钟，再次离心去除上清液。用0.5mL低盐缓冲液（10%蔗糖、10mMTris-Cl（pH8）、1mMEDTA（pH8））重悬细胞，室温静置5分钟即可。
（3）电注入转化
准备电注入缓冲液（10mMTris-Cl（pH8）、1mMEDTA（pH8）），将预处理后的大肠杆菌细胞与适量的质粒DNA混合，加入电注入仪中的电注入室。设定电压、脉冲时间和间距等参数（可参考表1），通电后将转化混合物立即转移到70mLLB培养基中，在37℃恒温摇床上培养数小时。
（4）PCR验证和酶切分析
选取转化后的菌落进行PCR验证，以证明质粒确实已被转入。同时，还可以进行酶切分析，以证明质粒被完好地转化并纯化到细胞内。
结果
电注入条件的优化
本文改变了电注入缓冲液浓度、电压、脉冲时间和间距等条件，通过测定转化效率来确定最佳的电注入条件。结果表明，采用0.1cm间距、2.5kV电压、10ms脉冲时间、室温静置5分钟的电注入条件的转化效率最高（如图2所示）。
不同浓度DNA对转化效率的影响
本文选取了不同浓度的质粒DNA进行电注入转化实验，测定转化效率。结果显示，在一定范围内，随着DNA浓度的升高，转化效率也随之升高。但当DNA浓度超过一定程度后，效率反而下降（如图3所示）。
PCR验证和酶切分析
本文对转化菌落进行PCR验证，结果显示，转化的菌落中确实存在目标DNA片段。同时，通过酶切分析，也证明了目标质粒成功纯化到细胞内，并避免了质粒的降解和损伤（如图4所示）。
讨论
质粒电注入是分子生物学中常用的一种方法。本文采用了pBR322作为目标质粒，研究其在大肠杆菌HB101中电注入转化的技术优化和效率。结果表明，采用0.1cm间距、2.5kV电压、10ms脉冲时间、室温静置5分钟的电注入条件转化效率最高。同时，不同浓度DNA仍然对转化效率有一定影响，需要根据实际情况选择合适的DNA浓度。最后，通过PCR验证和酶切分析，证明质粒成功转化到大肠杆菌细胞内。
参考文献
1.Chen,I.,&Dubnau,D.(2004).DNAuptakeduringbacterialtransformation.NatureReviewsMicrobiology,2(3),241-249.
2.Hanahan,D.(1983).StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmids.Journalofmolecularbiology,166(4),557-580.
3.Sambrook,J.,&Russell,D