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从大约克猪乳中提取DNA用于mtDNAD-loop序列分析
引言：
分子遗传学技术的发展为动物的基因分析提供了一个非常好的方法。基因分析已成为近几年来动物分类、亲缘关系、遗传多样性、物种间的起源和演化等研究方向中常用的技术。脊椎动物的遗传多样性研究中，DNA分析技术特别是利用mtDNAD-loop序列分析已经成为最受欢迎的方法之一。
材料和方法：
样品收集：
样品收集是进行mtDNAD-loop序列分析必不可少的第一步。我们选择大约克猪这个样品，它是一种重要的农业动物，具有很好的生长和繁殖性能。从15个成年大约克猪的血液中，我们采集了2ml左右的静脉全血，并将其置于EDTA抗凝剂管中，再转移至-80℃的冰箱保存。在进行DNA提取前，需要充分融化离心，将血液离心高速5分钟，去除血浆，用PBS洗涤1-2次后，将细胞沉淀进行DNA提取。
DNA提取：
为从大约克猪乳中提取出DNA，使用了常规的CTAB法以得到更高的质量。DNA提取分离过程如下所示：
步骤1：将样品在10倍约高纳氏琼脂糖(1XPBS)缓冲液中较缓慢地旋转均匀。
步骤2：样品加入SDS,用减数甲醛浓缩至0.3％，再加入EDTA与NaCl，混合均匀。
步骤3：样品与等体积的草酸盐混合，首次旋转，其他步骤可以放在恒温恒湿的水浴中。
步骤4：将混合物的DNA分离，清除其他组分(如蛋白质等)，使其从溶液中沉淀。
步骤5：用70%的酒精洗涤沉淀物，离心、洗涤、干燥后加入少量TE缓冲液(10mMTris-HCL,1mMEDTA,PH7.5)，加热浸泡。
步骤6：测定DNA的浓度和纯度。
PCR扩增：
mtDNA-D-loop区域的PCR扩增是进行序列分析的必要步骤。任务是扩增出基因组的DNA片段并纯化。
Primers：
我们使用的D-loop区域特定引物是根据大约克猪的mtDNA-Dloop区域设计的，引物序列为PDloop-Fforward5-TAAGGAGGTAAAAGCCCTCCTAA-3和PDloop-Rreverse5-CTTCAGCCATGACAGCAAATG-3，通过测序方法鉴定引物在目标DNA中的比对情况。
PCR反应体系：
0.2ulPfxDNApolymerase,其他成分混合，100ul,且样品在反应体系中的浓度应该尽可能最低。反应条件为首先96°C预热，随后是35个PCR循环，以及每个PCR循环所需的恰当的温度和时间。
PCR产物纯化：
通过电泳方法检测PCR反应产物，然后利用生物洗脱法对产物进行纯化。具体步骤是向PCR反应产物中添加1倍终止缓冲液，并将其加入柱子内。等待一段时间后，通过洗脱液中置入适量的溶液，使DNA移出柱子，纯化后的产物收集在收集管中。测定DNA产物的体积和浓度，使其输入到序列反应中。
测序和数据分析：
mtDNA-D-loop序列分析的最后一步是测序，这可以通过染色体测序的多种方法来完成，如Sanger测序等。经过反复测试和鉴别验证，最后获得的序列由R管理并进行最后一次验证。
结论：
大约克猪mtDNA-D-loop区域的测序结果表明，mtDNA-D-loop区域是一个非常有价值的遗传标记，可用于鉴定品种、性别鉴别、物种的起源和遗传多样性研究，可以联合使用其他分析技术，以进一步分析和比较动物个体之间的差异和相似之处。我们的研究为大约克猪mtDNA-D-loop序列提供了一个高精度、高分辨率的描述，从而为我们深入研究动物遗传学制定了难以替代的基础。