猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的多重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.docx

猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的多重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
引言：
食源性疾病对人类健康造成了巨大威胁。其中，食物中的细菌污染是最常见和造成人类感染的主要途径之一。猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌是影响食品安全的主要细菌，常引起胃肠症状等不良反应。因此，快速、准确地检测这些致病菌成为了重要的研究方向。
本研究旨在建立一种基于多重实时荧光定量PCR技术的细菌检测方法，可以实现对猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的快速、准确检测。
材料与方法：
1.实验菌株：从实验室保存的菌株库中选取猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌，分别进行预培养、接种，制备成不同浓度的细菌悬液。
2.DNA提取：采用商用提取试剂盒对样品进行DNA提取。
3.多重实时荧光定量PCR检测：PCR反应体系包括：10μl2×PCR反应体系，1μlDNA样品，0.4μl荧光探针，0.2μl引物混合物。PCR反应条件如下：首先在95℃下进行1min的热变性，然后在50个循环中进行95℃20s，60℃20s，72℃20s，然后在50到95℃逐渐升温检测荧光信号。细菌的定量检测采用荧光曲线法。
4.统计分析：计算PCR检测结果的灵敏度、特异性和线性范围。
结果
1.检测限度：本研究构建的多重实时荧光定量PCR检测方法对猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的最小检测量均为10CFU/50μL，这表明该方法对上述三种致病菌的检测阈值非常敏感。
2.线性范围：通过实验，我们发现该方法对猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的定量范围为10-106CFU/50μL，这表明本方法可以用于检测不同浓度下的猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌。
3.特异性：我们检测了其他细菌如大肠埃希氏菌、水仙菜链球菌、金黄色葡萄球菌，结果显示，这些菌株均未被本研究的多重实时荧光定量PCR检测方法检测到，这表明所建立的方法具有较高的特异性。
结论：
本研究成功建立了一种基于多重实时荧光定量PCR技术的细菌检测方法，可以实现对猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的快速、准确检测。该方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等特点，可以作为一种有效的检测细菌的方法，为食品安全领域提供了技术保障。