桑国俊卵母细胞体外培养技术研究培训课件.ppt

桑国俊一发展背景
二试验内容
三结果与分析
四总结一发展背景随着胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的发展，胚胎需求量日益增加，单纯依靠超数排卵获得体内胚的方法成本高、采胚数量有限，不能满足科研和生产的需要。卵母细胞体外胚生产体系的建立将成为胚胎生产的主要突破点。深入研究卵母细胞体外胚及其冷冻保存的技术机理，建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保存胚胎的技术体系，挖掘优良母畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义二试验内容试验内容…技术路线试验内容…试验设计

1卵母细胞体外成熟培养
1.1COCs级别对卵母细胞成熟的影响
1.2卵泡直径对卵母细胞成熟的影响
2卵母细胞体外受精
2.1不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响
2.2不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响
2.3精子浓度对卵母细胞受精的影响
3胚胎体外培养
3.1共培养体系对胚胎发育的影响
3.2培养液体积对胚胎发育的影响
4冷冻保存COCs的培养
4.1GL和EG一步法冷冻对COCs的影响
4.2麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响
SPSS统计分析三结果与分析1卵母细胞体外成熟培养
1.1COCs级别对卵母细胞成熟的影响

选择A、B级COCs进行成熟培养1.2卵泡直径对卵母细胞成熟的影响

卵母细胞的成熟率与卵泡直径关系密切，在卵母细胞体外培养过程中，宜选择卵巢发育正常的卵泡采集，而不宜选择发育过大或过小的边际卵泡2卵母细胞体外受精
2.1不同离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响

①二次离心沉淀液：精子活力0.44；获能效果10min最高为0.41，15min为0.32，超活化以15min时最好；受精率为40.19%
②二次离心上清液：精子活力0.56；获能效果10min最高0.59，15min时较低为0.585，超活化也以15min时最好；受精率为43.21%从试验结果看，宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法，避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路，而直接对上清液进行离心处理，获得了理想的精子洗涤和获能效果2.2不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响
室温上浮法：20～24℃室温。上浮60min，45min活力最高0.68，对其获能15min后进行体外受精，平均受精率41.40%恒温上浮法：CO2培养箱（38.5℃）上浮60min，30min活力最高0.697，对其获能15min体外受精，受精率41.51%二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著（p＞0.05），恒温上浮法的效果略高于室温组。室温随着季节和气候变化而变化，始终处于不稳定状态，精子活力升降比较零乱，而恒温上浮的条件稳定，精子活力升降序列比较整齐，在本试验中的优势虽不明显，如从可控角度考虑，还以恒温上浮法为宜培养液表.xls2.3精子浓度对卵母细胞受精的影响

本试验表明精子适宜浓度宜控制在1.0～1.5×106个/ml3胚胎体外培养
3.1卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响卵母细胞体外胚的发育受到多种因素的影响，培养过程中要摸拟卵母细胞或胚胎在子宫中的条件，给细胞发育创造良好的环境。卵母细胞体外受精过程中明显存在发育阻滞，克服发育阻滞的主要手段是用共培养系统提高卵裂率和桑、囊胚发育率。本试验通过添加共培养物质，较好地克服了体外胚的发育阻滞处理大体积培养液培养的体外胚、桑、囊胚率均较高于微滴培养
胚胎培养液的体积与培养系统的稳定性和液体蒸发有关。培养液量小，胚胎平衡培养的微环境差，培养环境易随外围环境的变化而改变；培养液体积过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓度降低，不能有效地促进胚胎正常发育4冷冻保存COCs的解冻培养

4.1GL和EG一步法冷冻对COCs的影响
COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养

冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存（p＞0.05），但EG的效果比较好成熟率4.2麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响

以麦管和OPS管作为冷冻载体，二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养

OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法（p＞0.05），而麦管法宜于操作和储存，宜在实际操作中选用麦管法成熟率4.3COCs冷冻方法的比较

COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致，整体效果的优势序列为EG法＞GL法＞OPS管法＞麦管法
玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂，建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法四总结1COCs级别选择A、B级COCs进行卵母细胞成熟培养
2卵泡大小选择直径2～8mm卵泡的COCs进行