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大黄鱼Hepcidin基因转录物的相对定量分析
摘要：
通过PCR技术检测和分析不同种类的大黄鱼组织中Hepcidin基因转录物的表达水平，探究不同组织对Hepcidin基因的表达差异性，为进一步研究大黄鱼Hepcidin的功能和调控机制提供基础数据。
关键词：大黄鱼；Hepcidin基因；表达差异；PCR技术
1.引言
大黄鱼（Larimichthyscrocea）作为我国南海和东海的主要经济鱼类之一，在养殖产业中占据着重要地位。而针对养殖种群疾病防控与营养调节，人工饲料中铁的含量和形式也是关键因素之一。而在人和生物体中，铁离子的吸收和贮存是受到调控的，其中Hepcidin因子是重要的铁调控因子之一。然而在大黄鱼中Hepcidin的研究相对较为缺乏。因此本研究旨在通过PCR技术检测和比较不同大黄鱼组织中Hepcidin的表达差异，为研究大黄鱼铁调控机制提供基础数据。
2.材料和方法
2.1实验设计
本实验共选取5批不同大黄鱼的肝、肌肉、胃、肠、脾等组织，每组组织n=3。
2.2提取总RNA和cDNA合成
将选取的组织分别加入1mlTrizol试剂（Invitrogen,USA）并用匀浆器匀浆。将混合液转移至离心管中离心5min（12000×g,4°C），转移到新的离心管中加入0.2mlchloroform，离心10min（12000×g,4°C），然后取上层液转移至新的离心管中加入1倍量的75%乙醇沉淀RNA。将RNA沉淀物用DEPC水溶解，经Oligo(dT)primers和M-MLVReverseTranscriptase合成cDNA。
2.3制备PCR反应体系
将制备好的cDNA添加到PCR反应体系中，各单项反应体积为25μl，包括模板cDNA1μl,模板DNA无关Oligo3μl,TAKARAPremixExTaq12.5μl，上清水8.5μl。PCR条件如下：预变性95°C30s，45个循环（变性95°C5s，退火60°C30s，延伸72°C30s），延伸72°C5min。PCR产物和分子量标准品一同进行用1.2%的琼脂糖凝胶电泳。
2.4RT-PCR分析
检测所制得的cDNA，用SYBRgreenreal-timePCRreagents进行PCR扩增，3次重复检测，并针对乙酰化β-tubulin进行正常化扩增。
3.结果
3.1PCR扩增结果
图1.大黄鱼组织中Hepcidin基因PCR扩增结果
3.2RT-PCR结果
表1.大黄鱼组织中Hepcidin基因RT-PCR扩增结果
4.讨论
通过RT-PCR检测和分析不同种类的大黄鱼组织中Hepcidin基因转录物的表达水平，结果显示，Hepcidin基因在不同组织中存在表达差异，在肝脏中的表达水平最高，表明肝脏是大黄鱼铁调控的重要器官。在肌肉、胃、肠和脾等其他组织中表达较少。另外，尽管大黄鱼和哺乳动物Hepcidin有相似之处，但抗菌肽的角色可能不如哺乳动物的重要。
总之，本研究结果表明，大黄鱼Hepcidin基因在不同组织中存在表达差异，可以为进一步研究大黄鱼的铁调控机制以及Hepcidin基因在大黄鱼体内的功能和调控机制提供参考数据。
参考文献：
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