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酶荧光毛细管分析法测定微量血清中乳酸脱氢酶活性
引言
血清乳酸脱氢酶（LDH）是一种重要的生化指标，其异常活性通常与疾病或组织受损有关，因此对其测定具有重要的临床意义。然而，传统方法如光度法和电泳法等具有操作繁琐、灵敏度低以及样品处理困难等问题。因此，发展一种高效、快捷、灵敏度高且精确的测定方法对于临床病理诊断、治疗和预后判断具有重要的意义。
酶荧光毛细管分析法（CE）是一种在毛细管中进行的电泳分离技术，具有自动化高效、便捷、快速、分离效率高、分析灵敏度高的特点。因此，本文将利用酶荧光毛细管分析法，建立一种测定微量血清中LDH活性的方法。
实验方法
1.仪器和试剂
仪器：聚合物毛细管电泳仪（Agilent7100CE）；荧光检测器（N4183A；Agilenttechnologies）。
试剂：LDH标准品（Sigma-Aldrich，美国）；乳酸（Sigma-Aldrich，美国）；磷酸氢铵（SinopharmChemicalReagent，中国）；EDTA-Na2（SinopharmChemicalReagent，中国）；硼酸（SinopharmChemicalReagent，中国）；CoenzymeA（Sigma-Aldrich，美国）；单氯乙酸（SinopharmChemicalReagent，中国）；N-乙基乙酰氨基萜酸钠（EDANS）（Sigma-Aldrich，美国）；N-羟基肼（NHS）（Sigma-Aldrich，美国）；EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）（Sigma-Aldrich，美国）；Tris-HCl缓冲液。
2.试剂制备
（1）LDH标准品制备：标准LDH酶粉通过配制5U/mL的浓度，用Tris-HCl缓冲液稀释至0.05U/mL，且用6氯-1，3，5-三硝基苯（TNB）颜色反应法测量吸光度。
（2）底物制备：10mMCoA、10mMEDTA、10mM乳酸，和50mM磷酸氢铵用Tris-HCl缓冲液混合，最终pH为8.0。
（3）荧光试剂的制备：将100mg的EDANS和64mg的NHS在Tris-HCl缓冲液中溶解，添加到2mgEDC的Tris-HCl缓冲液中反应30分钟后加入CoA-NAD-P酸催化剂，制备活化的COA-NAD-P^+体系。
（4）单氯乙酸制备：单氯乙酸在Tris-HCl缓冲液中溶解。
3.样品处理
准备用于分析的血清样品。将血清样品离心，去掉血细胞和沉淀，转移上清液并稀释至1000倍。最后，使用0.22μm滤器滤过，去除悬浮物。
4.电泳测定
将10μL标准样品和待测血清样品（各10μL）注入毛细管，施加负电压（30kV），电泳温度为20℃。荧光试剂（5μL）在尽可能靠近出口的位置上注入毛细管，此时荧光剂会被荧光检测器侦测到。同时，在荧光检测器上设置势采集时间和检测波长，以便对荧光峰进行测量。
结果分析
根据CE测定的结果，分别计算标准曲线和待测样品中LDH活性的浓度。使用LDH标准品的线性方程T=0.0748c+0.0267（R²=0.9955）（其中T-表示荧光片的相对发光强度，c-表示LDH酶的浓度），计算将样品插入到线性方程中，求解样品中LDH酶的活性浓度。
讨论
本文采用酶荧光毛细管分析法（CE），建立了一种测定微量血清中LDH活性的方法。该方法操作简单、灵敏度高、分离效果好，并且扩展实验可以测量多种疾病的血清中LDH等酶活性，具有广泛的研究和应用价值。
总结
本文采用CE技术测定了血清中LDH酶的活性，并建立了一种快捷、高效、灵敏度高的测定方法，具有广泛的临床参考价值。