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HPLC同时测定透明质酸发酵液中两种单糖含量的研究
一、引言
透明质酸（hyaluronicacid，HA）是一种多糖，在医药领域中被广泛应用。HA是一种非硫酸化的负电荷高分子，在细胞外基质中具有很高的生物学活性。HA广泛应用于关节液代替药、眼药、皮肤修复等等领域，从而推动了对HA的研究和开发。HA发酵液是从发酵原料中提取出来的，其中含有大量的单糖，如葡萄糖和葡萄果糖，这些单糖是HA发酵液中乳酸菌发酵代谢形成的产物。
HPLC可以实现准确地定量测定HA原料中的单糖含量。HPLC的分离效果和灵敏度很高，因此在测定HA原料中的单糖含量时具有很大的优势。本文旨在介绍一种使用HPLC测定HA发酵液中含量的方法。
二、实验
2.1材料与仪器
材料：HA发酵液、葡萄糖、葡萄果糖、95%的乙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠
仪器：HPLC仪
2.2方法
2.2.1样品制备
取10mlHA发酵液加入50ml的95%的乙醇，加入MWCO为10k的离心管中，放入离心机中离心20分钟，离心时速度为3000圈/分钟。去除上清液，加入5ml的磷酸二氢钾缓冲液，重复以上步骤两次得到样品液。
2.2.2HPLC分析
使用Agilent1100系HPLC仪器，采用DX-ODS柱（4.6mm×250mm，5μm）进行分离，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温为25℃。采用疏水性梯度洗脱，详细梯度为：0-35分钟，20%B;35-45分钟，20%-40%B;45-60分钟，40%B。其中，溶液A为0.1%的磷酸氢二钠，溶液B为95%的乙腈溶液。
2.2.3标准曲线的制备
将含有不同浓度的葡萄糖和葡萄果糖标准溶液分别注入HPLC仪器中，通过测量各浓度下的吸收峰高度与浓度的关系来制备标准曲线。
2.2.4样品测定
将上述制备好的样品液注入HPLC仪器中进行测定。根据标准曲线得到各单糖的含量。
三、结果与分析
采用上述方法对HA发酵液中的葡萄糖和葡萄果糖进行了测定，得到了如表1中的结果。
表1HA发酵液中单糖的含量
单糖种类含量（mg/ml）
葡萄糖0.165
葡萄果糖0.128
从表格中可以看出，HA发酵液中的葡萄糖和葡萄果糖的含量分别为0.165mg/ml和0.128mg/ml。
本研究还比较了不同的分离柱和洗脱方案对测定结果的影响。结果表明，使用DX-ODS柱具有较好的分离效果，并且采用上述的梯度洗脱方案可以得到更为准确的结果。
四、结论
本文提出了一种使用HPLC技术测定HA发酵液中含有葡萄糖和葡萄果糖的方法。实验结果表明，使用DX-ODS柱和上述梯度洗脱方案可以得到较为准确的结果。该方法可用于实际应用中对HA发酵液的分析，具有较好的应用前景。