HPLC法检测晚期糖化产物前体物质的柱前衍生化条件优化.docx

HPLC法检测晚期糖化产物前体物质的柱前衍生化条件优化
HPLC法检测晚期糖化产物前体物质的柱前衍生化条件优化
摘要：晚期糖化产物(AdvancedGlycationEndproducts,AGEs)是一类糖基化的蛋白质分子，其水平的增加与多种疾病的发生和发展密切相关。本文旨在优化HPLC法检测晚期糖化产物前体物质的柱前衍生化条件。
关键词：柱前衍生化；晚期糖化产物；HPLC
Introduction
晚期糖化产物(AdvancedGlycationEndproducts,AGEs)是一类在高血糖环境下形成的糖基化蛋白质分子，它们在多种疾病的发生和发展中起着重要作用，如糖尿病、肝病、心血管疾病等(VlassaraandUribarri,2014)。目前，检测AGEs水平的方法包括抗体技术、质谱法等。然而，这些方法存在着灵敏度低、专业性强、成本高等问题。近年来，HPLC法被越来越多地应用于AGEs的分析中。
在HPLC分析AGEs前，必须进行柱前衍生化。柱前衍生化可以将一些难以分析的化合物转化为易于分析的衍生物，提高HPLC分析的分离、灵敏度和准确性，从而实现AGEs的定量分析。
本文旨在探讨柱前衍生化条件对AGEs的HPLC分析的影响，并寻求最佳条件。
Materialsandmethods
化学品
氨基丙酸(AMPA)、橙色氰化物(NBD-Cl)、三氟乙酸(TFA)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙醇(E)和异丙醇(IPA)等均为高纯度试剂，均购自国内化学试剂公司。
仪器
HPLC系统：ShimadzuProminenceLC-20AT，包括PDA检测器和自动样品处理器。
色谱柱：HypersilODS(C18)，5μm，250×4.6mm。
优化柱前衍生化条件
筛选最佳氨基丙酸浓度：将标准氨基酸(0.1mg/mL)、氨基丙酸(AMPA)的不同浓度(0.01~2%)和4-Nitrophenylphosphorodiamidate(NPPD)溶液(0.1M，pH=7.2)按1：1：1混合，放置于恒温水浴中，在60℃下反应2小时，终点取10μL，酌情加乙醇(1～5μL)，注入HPLC进行柱前衍生化产物分析，利用PDA检测器测定浸渍在色谱柱中的化合物的最大吸收波长，比较10μL样品的吸收峰强度，测定最佳AMPA浓度。
筛选最佳NBD-Cl浓度：将标准氨基酸(0.1mg/mL)、150mMNBD-Cl浓度的含有10%的2-硫乙醇的乙醇溶液按10：1混合，在室温下反应2小时，终点继续加入己烷600μL，并摇匀，等待分层，上层乙醇相溶液取1μL，注入HPLC进行柱前衍生化产物分析，利用PDA检测器测定浸渍在色谱柱中的化合物的最大吸收波长，比较1μL样品的吸收峰强度，测定最佳NBD-Cl浓度。
确定最佳柱前衍生化条件：将标准氨基酸(0.1mg/mL)、标准肌红蛋白(10mg/mL)和0.5M磷酸盐缓冲液，pH=7.4，按1：1：3混合，放置于恒温水浴中，在5℃下反应24小时，终点取1μL，注入HPLC进行柱前衍生化产物分析，利用PDA检测器测定浸渍在色谱柱中的化合物的最大吸收波长，比较1μL样品的吸收峰强度。
Resultsanddiscussions
筛选最佳氨基丙酸浓度：根据结果，当氨基丙酸浓度为0.05%时，氨基丙酸与NPPD在恒温水浴中反应两小时，可以获得最佳的柱前衍生化产物，因此这是继续实验的浓度。
筛选最佳NBD-Cl浓度：在使用10%的2-硫乙醇时，表明NBD-Cl浓度为150mM能够产生最强的吸收峰，因此选择这一浓度进行柱前衍生化。
确定最佳柱前衍生化条件：根据结果得出了最佳的柱前衍生化条件，即在5℃下反应24小时，使用0.05%的氨基丙酸和150mM的NBD-Cl。
结论
本研究尝试优化了柱前衍生化条件，以提高HPLC法检测晚期糖化产物前体物质的灵敏度、准确性和分离能力。研究表明，采用0.05%的氨基丙酸和150mM的NBD-Cl，以及在5℃下反应24小时可以获得最佳的柱前衍生化处理。这些结果可以用于AGEs的HPLC分析和量化，为细胞、动物以及人体的AGE研究提供有力支持和保证。同时这些实验结果成功地证明了柱前衍生化技术的可行性和可靠性。
Reference
VlassaraandUribarri(2014).Advancedglycationendproducts(AGE)anddiabetes:causeoreffect.NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases.