奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌小菌落突变株的表型鉴定及其遗传基础分析.docx

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌小菌落突变株的表型鉴定及其遗传基础分析
引言
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一种广泛存在于环境、动物及人体表面皮肤及粘膜上的常见细菌。同时，寄生在哺乳动物乳腺部位的金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳房炎也成为了一大严峻问题。这种病害会导致奶牛乳产显著下降，营养健康被破坏，严重的甚至会导致乳果不适宜食用。由于金黄色葡萄球菌具有高度的多重耐药性，因此使用抗生素的方法治疗也日益困难。
本文通过对金黄色葡萄球菌小菌落突变株进行表型鉴定，进而探究小菌落突变株的遗传基础，以期为寻找新的治疗方法提供理论依据。
实验材料与方法
金黄色葡萄球菌小菌落突变株的构建
采用Tn4001的插入元件（Kreiswirthetal，1983），将pMAD作为载体质粒，合成pMAD-TetM-Tn4001，使用电转化法，将pMAD-TetM-Tn4001转化到金黄色葡萄球菌（RN4220)，在含氯霉素的THY平板上筛选克隆。进行溶液克隆和筛选，生长在10ml含氯霉素的THY液体培养基中，25度摇床定植，至OD600（OD值）=0.3时，1MHCl调节至PH6.5，加入20％的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酸盐（IPTG），培养12小时，以10倍稀释的方式依次在含有20％亲体素（X-GAL）和氯雷他定的THY平板上选出白色菌落和小菌落。
表型鉴定和遗传基础分析
选取小菌落突变株进行表型鉴定，对突变菌株进行荚膜形成、半透明圈、确证左右反转等鉴定。同时，通过基因克隆、测序、Southern印迹和PCR核苷酸测序等方法对小菌落突变株的遗传基础进行分析。
结果
金黄色葡萄球菌小菌落突变株的表型鉴定
对金黄色葡萄球菌小菌落突变株进行荚膜形成鉴定后，结果显示突变株的荚膜形成率低于野生型；对半透明圈鉴定，发现突变株生成的半透明圈区域较小；左右反转鉴定结果表明，突变株可能出现左右反转现象。
金黄色葡萄球菌小菌落突变株的遗传基础
通过基因克隆、测序、Southern印迹和PCR核苷酸测序等方法对小菌落突变株的遗传基础进行分析，发现Tn4001转位子已插入uup起始密码子和uvrC第一个密码子之间，破坏了uup和uvrC间的编码序列，破坏了这一区域的功能。这表明，该小菌落突变株是由Tn4001子载体插入了uvrC（突变细胞的外切片中有UV-R敏感的酶，DNA损伤后可以修复DNA被破坏的环节）和uup（突变株被光线或化学物质最终产生DNA损伤，导致细胞死亡）基因间的DNA序列，并导致uvrC和uup的表达降低或消失。
讨论
本研究研究了金黄色葡萄球菌小菌落突变株，发现小菌落突变株荚膜形成率低于野生型，生成的半透明圈区域较小，由此推断突变株可能出现左右反转现象。同时，利用基因克隆、测序等方法对小菌落突变株进行遗传基础分析，发现该小菌落突变株是由Tn4001子载体插入了uvrC和uup基因间的DNA序列，并导致uvrC和uup的表达降低或消失。
基于以上结果，我们可以得出结论：突变株对细胞环境的感知和应答能力降低，容易出现DNA损伤。此外，小菌落突变株的荚膜形成率降低，半透明圈近似面积减少，说明小菌落突变株的愈合能力也下降。这为研究小菌落和荚膜的产生，以及细菌的免疫应答机制提供了一定的理论基础。
结论
通过对金黄色葡萄球菌小菌落突变株进行表型鉴定及其遗传基础分析，我们发现该株突变株荚膜形成率降低，半透明圈近似面积减少，左右反转现象可能出现；同时，通过基因克隆、测序等方法对小菌落突变株进行遗传基础分析，发现该小菌落突变株是由Tn4001子载体插入了uvrC和uup基因间的DNA序列，并导致uvrC和uup的表达降低或消失。这些结果有望为探究细菌的免疫应答机制和小菌落及荚膜的产生提供重要参考。