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志贺氏菌检测和分群实时荧光PCR方法的建立
摘要：
志贺氏菌是引起食物中毒的主要病原菌之一。传统的志贺氏菌检测方法耗时长、操作复杂、有一定的风险，但实时荧光PCR技术可以快速、准确的检测志贺氏菌，具有高灵敏度和高特异性。本论文建立了一种基于实时荧光PCR技术的志贺氏菌检测和分型方法，通过不同的分型结果可以更好的分析和控制志贺氏菌感染。
关键词：志贺氏菌；实时荧光PCR；分型
引言：
志贺氏菌是一种致谢细菌，常引起人类食源性细菌感染（食物中毒），是全球卫生领域的重要问题之一。传统的志贺氏菌检测方法大都依靠培养菌落、光学显微镜提取单个菌落观察并进行生化试验。该方法耗时长、操作繁琐，且对培养条件敏感，加上志贺氏菌可在食品中生存数日之久，因此即使对突发食物中毒进行追踪诊断，准确率仍然无法得到保证。实时荧光PCR技术采用了荧光信号的On-line检测系统，在PCR反应过程中实时检测PCR产物的数量，能够快速、准确地检测志贺氏菌，能够实现检测的自动化，减少了误差，是近年来食物检测领域的热点之一。
材料和方法：
1.样品处理
样品来源是饮食污染样品，样品用浓度为9‰的鹰精液（鹰精液是一种常用的细胞破解液，可溶解细胞膜），并经过超声波处理和离心处理，去除残留颗粒和其他污染物。这个样品可以在普通病原检测的基础上对志贺氏菌的检测起到很好的作用。
2.实时荧光PCR引物设计
该实验室利用NCBI在全球分离的志贺氏菌获得的genbank序列信息，根据囊膜醇的比例、脂肪酸的比例、甘油三酯等生化指标选择适当的序列，设计检测和分型引物。根据引物比对分析，最优引物长度为180bp，可检测到志贺氏菌O157:H7的2个位点。
3.实时荧光PCR反应体系
模板DNA的摩尔浓度为10^-9到10^-6。根据实验室利用专业蛋白质检测设备测出的模板DNA的浓度，选择相应的稀释倍数。对于固定体积的总体积为50μL的实时荧光PCR反应体系，首先要从冰箱中取出物品并等室温水将该物品培养20-30min;0.5MPCR缓冲液，MgCI2浓度为2.5mmol/L，QSY®双探针(1μM)；Taq多聚酶0.025Unit/μL。以相应的孔板的形式电容入220UL制备好的实时荧光PCR反应体系，在离心前轻微震荡。
4.分型方法
筛选志贺氏菌样品后，使用PCR扩增技术对其进行分型。将PCR产物直接进行质谱分析可得到PCR产物的分子大小和序列的组成，这种方法具有诊断速度快、准确性高等特点。
结果：
在本实验室中，比较了传统的细菌培养盘和基于实时荧光PCR技术的志贺氏菌检测方法对样品的检测结果。实验结果表明，基于实时荧光PCR的检测方法能够更加快速、准确的检测到志贺氏菌，且有更高的灵敏度和特异性。特别是在生产厂家合格检验、突发事件应对和进口食品贸易等领域的快速鉴定方面，基于实时荧光PCR技术的检测方法具有很强的优势。
结论：
本实验室建立了一种基于实时荧光PCR技术的志贺氏菌检测和分型方法，该方法在检测志贺氏菌方面具有优越性能。与传统的生物学检测方法相比，该方法不仅快速、准确，还可以在物种、亚型水平上进行检测和鉴定。这种方法的使用可以减少传统实验室工作的开销，同时提高测试质量和安全性。它不仅可以应用于食品安全检测，还可以应用于其他领域，如环境监测、传染病监测、药品等。因此，该方法具有极高的实际应用价值。