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牛乳中白色念珠菌和近平滑念珠菌双重定量PCR检测方法的建立
引言
白色念珠菌和近平滑念珠菌是常见的牛乳中的细菌，它们常常会影响牛乳的品质和安全。因此，对这两种菌的快速检测和定量十分重要。本文将介绍一种基于PCR技术的双重定量检测方法，用于测量牛乳中白色念珠菌和近平滑念珠菌的数量，从而为检测牛乳中的菌群提供了一种可靠，敏感和特异的方法。
材料与方法
白色念珠菌和近平滑念珠菌的菌种和试剂
本研究所使用的白色念珠菌和近平滑念珠菌菌株分别为ATCC90030和ATCC10231。PCR试剂包括：FastStartTaqDNA聚合酶、SYBRGreenI荧光染料、oligo(dT)20引物和特异的引物对。
样品处理
提取牛乳中的菌群DNA，使用DNA提取试剂组；测定DNA纯度和浓度，保证反应的灵敏度；将DNA样本用复代PCR扩增，以增加PCR反应中的特异性和减少假阳性的可能性。
PCR反应条件优化
确定PCR反应条件以保证反应效率和特异性。PCR反应在C1000TouchPCR系统下进行，反应体系为50μl，反应条件如下：初步变性3min，94℃；循环反应40次：94℃变性30s，55℃编码30s，72℃延伸1min；最后延伸7min，72℃。
PCR产物分析
反应产物按大小排序，并定量分析。将产物与大小标准重组，检测PCR产物的大小；使用琼脂糖凝胶电泳来检测PCR的特异性。
结果
PCR反应的最优条件下，可以检测到好的抑制背景，检测检测到了牛乳中各种数量的白色念珠菌和近平滑念珠菌。这项方法的检出限为10cfu/ml，检测青霉素等常用药物的灵敏度是良好的。检测到的PCR产物大小分别为535bp和627bp。通过琼脂糖凝胶电泳，可以进一步验证它们的特异性。
讨论
本文建立了一种牛乳中白色念珠菌和近平滑念珠菌双重定量PCR检测方法。该方法灵敏性高，特异性稳定，检出限低，可以高效地检测牛乳中的不同数量的白色念珠菌和近平滑念珠菌，为保证牛奶安全和品质提供了一种有力的方法。
结论
本方法具有较高的特异性、灵敏度和可重复性，是一种高效、实用的检测方法，适用于牛乳中白色念珠菌和近平滑念珠菌菌群的检测。并且，通过一定的改进和优化，还可以应用于其他食品和生物样品的检测。