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转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定值方法的建立
摘要
转基因技术是人类在农业、医学、科学等领域中取得的一项重大成果，其应用不断扩大。目前，生物安全性与健康问题在公众中引起了广泛关注。本文建立了一种转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定值方法，以应对公众关注的安全问题，同时进行增产增效。
关键字：转基因玉米，MON863质粒，数字PCR
引言
转基因技术是指应用生物技术手段将一些有用的外源基因转移到其他生物体中，从而获得一些有用或特殊的性状。转基因技术不仅可以改良作物的生长和产量，还可以提高作物的抗病能力。然而，作为新技术，转基因食品往往会引起一些争议，例如该食品是否对人体健康有害或对环境造成破坏等。因此，确保转基因食品的生物安全性和质量，对消费者的健康和产业的可持续发展极为重要。
MON863是一种Bt玉米品种，由美国公司Monsanto开发。该玉米品种基因中具有破坏玉米象等害虫肠道的功能。在2002年到2003年之间，MON863玉米被批准在欧洲联盟地区上市。然而，由于有关食品安全和质量的争议，欧盟在2006年重新审查MON863的评估结果，发现当初的安全风险评估存在不足之处，建议Monsanto再次进行研究以确保食品的安全性。因此，科学家需要建立一种准确、可靠的检测方法来检测转基因食品中的MON863质粒DNA含量。
方法
本研究建立了一种双重数字PCR定值方法来定量MON863质粒DNA。首先，用转基因玉米MON863和普通玉米进行对照実验。提取两种玉米粉的总DNA，用限制性内切酶各切割一次，然后在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。将特定的DNA片段扩增选出。用一个小的DNA支架将这个特定片段从扩增产物中提取出来，制备成标准质粒DNA，然后储存在-20°C的冰箱中。
其次，进行质粒复制数的确定。首先用荧光轨道扩增器进行定量PCR扩增，在区别DNA和RNA的酶内，将目标DNA片段扩增。然后，测量PCR扩增物的荧光值。通过计算无核算单位测量的荧光值和系数值，计算出每个PCR中含有多少复制的DNA。
最终，进行双重数字PCR定量。首先，利用实时荧光PCR技术对样品中的MON863质粒DNA含量进行定量。其次，用双重数字PCR对定量PCR数据进行校正。数字PCR是一种新兴的技术，它可以在没有参考基因组的情况下对目标DNA分子数进行定量。这项技术可以消除PCR中一些误差，比如来自样品体积的变异性。
结果
本研究建立了一种转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定量方法。首先，本研究从转基因玉米MON863和常规玉米中提取了总DNA，并用限制性内切酶切割，然后在琼脂凝胶中检测出特定的DNA片段。其次，通过制备标准质粒DNA和荧光PCR技术进行质粒复制数的确定。最后，本研究利用双重数字PCR对样品中的MON863质粒DNA含量进行定量。
标准曲线和基于这个曲线的定量数据表明，这种转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定量方法可以快速、准确地定量检测转基因玉米MON863中的质粒DNA。与已有研究相比，本研究的双重数字PCR定量方法具有以下优点：（1）具有高精度和高灵敏度，可以在样品中检测到更低的质粒DNA含量；（2）可以避免PCR反应体积的变异；（3）可以避免普通PCR方法中的碎片效应。
结论
本研究建立了一种新的转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定值方法。与其他定量方法相比，该方法具有显著的优势，具有高精度、高灵敏度、高可重复性，且可通过减少PCR反应体积中的变异性来有效地避免PCR反应中的误差。该方法的比较优势在于它可以检测样品中的非常低浓度的质粒DNA，并能有效避免PCR反应中的碎片效应。这种方法的建立对于将来的转基因作物安全检测和质量管理具有重要的意义。