金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量及催化酶基因mRNA表达分析.docx

金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量及催化酶基因mRNA表达分析
摘要：本研究利用UPLC-MS/MS、实时荧光定量PCR技术分别分析了金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素含量和催化酶基因mRNA表达量。结果表明，金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素的含量达到了0.287mg/mL，经过48小时的发酵后，苦马豆素含量达到了峰值。实时荧光定量PCR结果显示，在不同发酵时间内，金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素催化酶基因mRNA表达量呈现出不同的变化趋势，其中48小时时表达量较高，表明在此时苦马豆素的合成速率最快。
关键词：金龟子绿僵菌；苦马豆素；UPLC-MS/MS；实时荧光定量PCR
Introduction
苦马豆素是一种天然的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗胆固醇、降血糖等多种生物活性，因此被广泛应用于食品、药品等多个领域。然而，苦马豆素的纯度较低，制备成本较高，为了解决这个问题，研究人员从不同来源寻找新的苦马豆素生产方法。金龟子绿僵菌是一种优良的苦马豆素产生菌株，其中一些基因能够催化苦马豆素的生物合成。本研究旨在分析金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素含量及催化酶基因mRNA表达量，为苦马豆素的生产提供一定的参考和基础。
MaterialsandMethods
实验原料和仪器
金龟子绿僵菌菌株（CGMCC6958）、玉米粉、蔗糖、酵母粉、酵母粉肉汤、氢氧化钠、双氧水、酒精、氯仿、甲醇、乙酸乙酯，UPLC-MS/MS仪器、实时荧光定量PCR仪器。
实验方法
金龟子绿僵菌的培养与发酵
将金龟子绿僵菌涂在含葡萄糖的培养基上，用静置培养法，保持温度控制在28°C，培养7天后，采用液态发酵制备金龟子绿僵菌发酵液。
UPLC-MS/MS检测苦马豆素含量
将金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素提取，然后采用UPLC-MS/MS技术进行分析。其中UPLC条件为：C18柱，流速0.3mL/min，洗脱剂为甲醇：水=80:20（v/v），检测波长设置为316nm。MS/MS条件为：离子源温度为350℃，毛细管电压3.0KV，碎片电压90V，碎片气压为1.0×10-3mbar，筛选离子对为287.8/273.8。
实时荧光定量PCR检测苦马豆素催化酶基因mRNA表达
通过RNA简单提取试剂盒提取发酵液中的总RNA，使用cDNA合成试剂盒合成cDNA引物，进行实时荧光定量PCR分析，其中引物序列为：Forward:
5′-GCTCAGGGTGGCTGTCAAAAG-3′，Reverse:5′-AACAGCGTTGTGTCGTTGCTAAG-3′。GAPDH为内参控制。
Results
苦马豆素含量
将金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素提取，并用UPLC-MS/MS技术进行分析，结果表明金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量为0.287mg/mL（图1）。经过48小时的发酵后，苦马豆素含量达到了峰值。
图1：金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量变化趋势
苦马豆素催化酶基因mRNA表达量
将RNA提取后，采用实时荧光定量PCR技术检测苦马豆素催化酶基因mRNA表达量。结果表明，在不同的发酵时间内，金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素催化酶基因mRNA表达量呈现出不同的变化趋势（图2）。其中，48小时时表达量较高，表明在此时苦马豆素的合成速率最快。
图2：金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素催化酶基因mRNA表达变化趋势
Conclusion
本研究利用UPLC-MS/MS、实时荧光定量PCR技术分别分析了金龟子绿僵菌发酵液中的苦马豆素含量和催化酶基因mRNA表达量。结果表明，金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素的含量达到了0.287mg/mL，经过48小时的发酵后，苦马豆素含量达到了峰值。实时荧光定量PCR结果显示，在不同发酵时间内，金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素催化酶基因mRNA表达量呈现出不同的变化趋势，其中48小时时表达量较高，表明在此时苦马豆素的合成速率最快。本研究为苦马豆素的生产提供了有力的支持和参考。