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2024-12-07
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一种适合蚊虫总RNA提取及样本保存的方法
随着基因组学、转录组学等技术的发展,RNA提取已经成为了分子生物学研究中重要的步骤之一。在研究蚊虫的生命活动和科学探索方面,RNA提取是逃不开的一步。然而,由于蚊虫个体较小,并且蚊虫样品的数量时常需要大量的处理,因此针对蚊虫样品的RNA提取方法也需要被开发出来。本论文结合多篇文献的研究成果,总结出适合蚊虫总RNA提取的方法以及蚊虫样品保存方法。
1.蚊虫总RNA提取方法
1.1组织样品的采集与保存
在蚊虫总RNA提取过程前,组织样品的采集及保存是非常重要的。在采集过程中,为避免RNA降解,需要避免手接触到组织样品,且采集完成后的组织样品要立即冰冻存储。另外,避免重复冻融以模拟RNA降解。
1.2组织样品的研磨
因为蚊虫组织样品的大小比较小,一般需要对样品进行研磨处理。研磨的方法有很多,可以使用液氮,也可以使用试剂盒内配备的细胞破碎试剂。在使用细胞破碎试剂的方法中,需要注意的是研磨次数不要过多以避免样品的降解,同时还要注意细胞破碎试剂的使用时间。建议每次取出适量细胞破碎试剂使用,并在使用后立即放回冰箱保存。
1.3RNA的提取和纯化
对于蚊虫总RNA的提取,常用的试剂盒有QIAGENRNeasyMiniKit和Bio-RadRNAIsolationKit等。以QIAGENRNeasyMiniKit为例,提取总RNA的方法如下:
(1)将20mg的组织样品放到无菌2mL离心管中,加入600μL氯仿甲醇(4:1)混合液,翻转混合。
(2)在样品前面过滤膜的位置插入一个用量相符的管尖,设定最大旋转速度,放入试剂盒提取柱中,进行离心。将悬浊液加载到QIAGENRNeasyMiniKit试剂盒中。
(3)分步添加提取试剂并离心,根据试剂盒说明书的操作步骤完成以下工作:添加70%酒精,添加RW1(含β-葡萄糖苷酸酰胺),在前面过滤膜上洗脱液中添加RNAwash时缓冲液、尾端洗脱液和液氮冷却的DNaseI各一次,离心去除废液。
(4)为了保证总RNA的质量,需要给总RNA样品进行退火,在60°C的恒温箱中以110rpm的速度退火30min左右。退火完后进行RNA浓度和纯度检测。
2.蚊虫样品的保存方法
为了保证样品的RNA质量,不会因为冰冻样品的长时间保存而受到损坏或降解,建议使用以下方法进行保存:
(1)利用液氮保存
液氮能够让样品以最低的温度保存,防止样本RNA被降解。在保存过程中,需要使用专门的架子将样品放置于液氮中,同时需要注意每个样品的标签。在获取样品时,可用包裹液氮手套将样品放入样品管中,以免手接触到样品而容易导致样品RNA的降解。
(2)利用RNA保护剂(RNAlater)
RNAlater是一种液态的RNA保护剂,可用于保存蚊虫多种样本类型和组织样品。它的作用是迅速包裹RNA分子以保持其在切断的状态下稳定,适用于冰箱温度下低于-20℃和室内温度存储。在使用过程中,可以将RNAlater直接加入样品管中,避免RNA在保存过程中受到降解。
总之,蚊虫总RNA提取及样品保存是分子生物学研究中不可缺少的步骤。针对蚊虫样品,可以采用RNAlater保护剂进行保护,在提取的过程中,应注意组织样品的采集及保存,以保证总RNA的质量。市面上有多种试剂盒可供选择进行RNA提取,其中QIAGENRNeasyMiniKit操作步骤简单,且提取出的RNA质量高,常用于蚊虫总RNA的提取。
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