现代微生物遗传学---第四授课单元-课件讲义教材.ppt

第四授课单元第一节质粒的发现和命名第二节质粒编码的遗传表型3.产生抗生素的质粒
细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。
4.产生毒性的质粒(BT)
5.降解质粒：
假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长的细菌。其体内含有大量的降解质粒。
6.致病性质粒：
根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。7.共生固氮质粒
根瘤菌普遍喊有该类质粒。
包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作用可有正或负的调节作用。
8.隐蔽质粒(crypticplasmid)
酵母的2m质粒（p171）
长为2m的6kb的环状双链DNA分子
位于酵母细胞核内，50~100拷贝
只携带与复制和重组有关的4个基因，无遗传表型
质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和一个2.3kb小区域所间隔
两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重组，可使质粒互变异构成A型和B型。第三节质粒的检测一、质粒消除（理化因子和生物学方法）
理化因子消除法
消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等
如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还是染色体基因突变的结果呢？
回复突变情况
突变率
理化因子消除质粒的作用机制：
对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长中被淘汰
选择性抑制带有质粒的菌的生长。2.原生质体消除法
使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
四、质粒的分离、检测与纯化
质粒分离方法：碱变性法
菌体的培养和收集
溶菌
碱变性处理
离心分离
有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性，这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过离心，这样可以缩短提取质粒的时间。第四节质粒的复制与调节二、质粒的复制
1.质粒复制的方式(P120)
质粒的复制起点称为oriV,大肠杆菌为oriC。
复制主要通过型复制和滚环复制之一进行。其中以型复制为主（包括单向和双向）。
质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，其他复制蛋白都来自宿主。2.复制起点区oriV的功能和pBR322质粒
复制起点区oriV功能与质粒载体的构建、寄主范围三、质粒复制的调控1.抑制物-靶位调控
依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过它与质粒DNA复制引物或编码Rep蛋白（复制蛋白）的mRNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。
(1)ColE1质粒复制调控（P122图5-7）抑制物（负调控因子）：反义RNA、Rop蛋白
靶位：质粒复制的前提引物
机制：反义RNA和引物RNA互补结合，阻止其发挥作用；Rop蛋白具有强化反义RNA和引物RNA结合的作用。是抑制物对靶位的直接调控模型。
(2)R1质粒的复制调控
抑制物通过抑制Rep蛋白的形成而阻止了该蛋白对oriV的激活作用。是间接调控模型。
抑制物：
CopB蛋白：是PrepA启动子的阻遏蛋白；
copA基因转录产物RNA：Rep蛋白mRNA互补，抑制其合成
靶位：Rep蛋白的合成2.重复子-竞争结合调控
采用该机制进行调控的质粒为重复子质粒。
在复制起始位点ori和复制基因rep附近存在着多个长度为17~22bp的DNA短片段。这些短片段叫重复子。
重复子能与复制必需的Rep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。
pSC101、F、P1等都属于重复子质粒。重复子质粒复制调控机制（两种,p124-125）
(1)转录自体调控：RepA蛋白通过与自身启动子区的某些序列（如pSC101中的反向重复序列IR1和IR2）的结合而抑制自身的合成，这种方式叫做转录自体调控。(2)偶联模型调控：由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始，该方式即为偶联模型。
质粒浓度低时，RepA蛋白只与一个质粒结合；
质粒浓度高时，RepA蛋白通过与重复子序列的结合使两个质粒联结在一起，阻止质粒的复制。F质粒的复制调控
F质粒的复制区也含有19~22bp的重复序列，repE基因编码的RepE蛋白也是质粒复制所必需的。RepE蛋白是一种自体调控蛋白，可能也是通过与自身启动子结合对自身浓度进行调控。RepE蛋白通过与重复子序列结合抑制质粒复制。四、质粒之间的不相容性五、质粒的稳定性1.主动分配机理
该类质粒一般为低拷贝质粒。其稳定性通过质粒编码的基因产物来实现，包括编码主动分配体系的par区和致死基因。
par区：即分配区partitionregion，指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等分配到子细胞中的质粒DNA序列。
质粒的复制