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乙肝表面抗原ELISA检测程序

第一篇：乙肝表面抗原ELISA检测程序乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序1检验目的及原理1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。标本3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000RPM以上离心5分钟，分离血清。3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000RPM以上离心5分钟，分离血清。3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。检测系统4.1组成乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心ELISA试验试剂盒(英科新创科技有限公司)主要组成成份：包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、HBsAg样品稀释液（含BSA缓冲液）、浓缩PBS-T缓冲液、底物A（含H2O2）、底物B（含TMB）、终止液（含2MH2SO4）、封板膜，自封袋。试剂信息：以上构成仅对英科新创（厦门）科技有限公司的试剂盒有效，批准文号（国药准字S10910148），试剂储存于2-8℃避光保存，有效期六个月。4.2试剂配制（1）PBS-T缓冲液：取浓缩PBS-T缓冲液若干，以蒸馏水或去离子水按照20倍稀释成应用液。试剂保存：室温。4.3主要仪器TecanSunrise酶标仪、汇松PW-960酶标洗板机、20～200ul可调式微量移液器、25～56℃可调式气浴恒温振荡器。校准可调式微量移液器由武汉市技监局校准完成，酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责每年一次技术校准。检验程序6.1操作步骤6.1.1、平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。6.1.2、编号：取所需要数量微孔固定于支架，按序编号。6.1.3、稀释：每孔加入20ul样品稀释液。6.1.4、加样：分别在相应孔中加入100ul待测样本血清、阴阳性对照血清或质控血清。6.1.5、温育：置37℃温育60分钟。6.1.6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。6.1.7、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50ul。6.1.8、温育：置37℃温育30分钟。6.1.9、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。6.1.10、显色：每孔加底物A、底物B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。6.1.11、终止：每孔加入终止液50ul，混匀。6.1.12、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。6.2结果判断6.2.1、临界值Cutoff（CO）的计算：CO=阴性对照OD均值×2.1阴性对照OD均值低于0.05时，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。6.2.2、样品OD值S/CO≥1者，结果阳性样品OD值S/CO＜1者，结果阴性6.2.3、如果阴性对照OD均值>0.1或阳性对照OD均值6.2.4、注意：A.通过以上检测阴性的样品，由于方法学以及其他不可控因素影响，不能绝对保证样本中没有低滴度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。B.过以上检测阳性的样品，应通过人Anti-HBs的中和试验予以确认。如果样品在确证试验中发生中