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分子生物学实验方案

第一篇：分子生物学实验方案实验一分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备的使用（2学时）实验二分子材料的采集、保存和植物/动物基因组DNA的分离（8学时）实验三DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测（4学时）实验三聚合酶链式反应（PCR）（3学时）实验四PCR产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（6学时）实验五分子生物学软件的使用（4学时）实验六生物信息学（3学时）生物信息获取与利用实验考试实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA【目的要求】学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA纯度、含量和分子量。【实验原理】凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约3.5）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MWmarker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（opencircularDNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA>线性DNA>ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidiumbromideEB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直接加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，这样可以在电泳过程中随时利用紫外灯观察核酸的迁移情况。但是EB与DNA的结合会影响DNA的迁移率，因此对于需要较精确测定DNA片段大小、或需根据荧光强度测定DNA含量时，EB染色应在电泳结束后再进行（将凝胶浸入0.5μg/ml的溴乙锭水溶液中10min即可）。注意：EB是强诱变剂，使用EB必须戴一次性手套，不要洒在桌面地面上，被污染的物品必须专门处理后（加少量漂白粉可使EB分解），再彻底清洗或丢弃。指示剂溴酚蓝和二甲苯青的作用是指示样品在凝胶中的迁移过程，以确定终止电泳时间。在0.6%、1%、2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝分别约与1kb、600bp、150bp双链线状DNA片段的迁移率大致相同。在1%琼脂糖凝胶中，二甲苯青大致相当于2kb双链线状DNA的位置。【试剂器材】1．5×TAE：2．10mg/ml溴化乙锭（EB），避光4℃保存。/GoldView常温保存。3．6×上样缓冲液（配方见附录）4．（电泳）琼脂糖5．DNA、PCR扩增产物6．DNA标准分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式电泳槽、电泳仪8．透射式紫外灯9．胶带10．微波炉或恒温水浴11．微量移液器【操作步骤】1．称取琼脂糖1g，置三角烧瓶中，加入1×TAE100ml，置沸水浴或微波炉中加热，使充分溶解。注意：微波炉煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反复加