牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新.docx

牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新

第一篇：牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新牛奶中阿维菌素类药物残留检测—高效液相色谱法安全要求该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。急救措施皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。适用范围该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。职责进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。检测原理用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。方法灵敏度本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1µg/kg，定量限均为2µg/kg。注意事项7.1整个净化步骤控制C18柱流速约在1～2mL/min；7.2C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。材料、仪器、试剂的准备及基本要求除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。8.1阿维菌素标准品含量≥95.7%8.2多拉菌素标准品含量≥92.6%8.3伊维菌素标准品含量≥93.9%8.4乙腈色谱纯8.5甲醇色谱纯8.6三氟乙酸酐8.7三乙胺8.8异辛烷8.9N-甲基咪唑8.10C18固相萃取柱500mg/6cc，或相当者8.11固相萃取柱洗涤液；取乙腈30mL、水70mL和三乙胺20µL，混匀。8.12衍生化试剂a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。8.131mg/mL阿维菌素类药物混合标准贮备液：分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10mg，精密称定，于10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1mg/mL的混合标准贮备液，-20℃保存，有效期6个月。8.1410µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液：准确量取混合标准贮备液0.25mL，于25mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10µg/mL标准工作液。-20℃保存，有效期1个月。8.151µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液：准确量取10µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5mL，于25mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1µg/mL标准工作液。-20℃保存，有效期1个月。8.16高效液相色谱仪（配荧光检测器）8.17分析天平感量0.00001g8.18天平感量0.01g8.19振荡器8.20离心机8.21涡旋混合仪8.22聚丙烯离心管mL8.23氮吹仪8.24C18固相萃取柱500mg/6cc，或相当者8.25微孔滤膜0.45µm检验步骤9.1试料的制备9.1.1取混匀后的供试样品，作为供试试料。9.1.2取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。9.1.3取混匀后的空白样品5g,添加1µg/mL的工作液0.05mL，作为空白添加试料。9.2标准曲线的制备精密量取1µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1mL，于10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25mL，于50mL量瓶中，0.1、0.3mL至10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0mL于各自的10mL试管中，于50℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色谱测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。9.3提取9.2.1称取(5±0.05)g试料，于50mL离心管中，加乙腈8mL，涡旋混匀，中速振荡5min，5000r/min离心10min。9.2.2收集上清液于另一50mL离心管中。残渣再重复提取一次。9.2.3合并两次上清液，加水15mL和三乙胺50µl，混匀，备用。9.4净化9.4.1依次用乙腈5mL、固相萃取柱洗涤液5mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2将备用液过柱，抽干。加异辛烷3mL洗涤，抽干。9.4.3用乙腈5mL洗脱。收集洗脱液于10mL试管中，50℃下用氮气吹干。备用9.5衍生化向试管中依次加入衍生化试剂A液100µL和衍生化试剂B液150µL，密闭，涡动10s，依次加冰醋酸、三乙胺各50µL，涡动10s，密闭反应30min，加650µL甲醇混匀。经0.45µm微孔滤膜过滤，供高