嵌合抗ROR1抗体Fab分子及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107827984A(43)申请公布日2018.03.23(21)申请号201710820990.7A61P35/00(2006.01)(22)申请日2017.09.13G01N33/574(2006.01)(71)申请人张慧林地址210004江苏省南京市秦淮区天妃巷123号申请人朱进(72)发明人张慧林殷郑娜童华朱进(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人唐循文(51)Int.Cl.C07K16/28(2006.01)C12N15/13(2006.01)C12N15/70(2006.01)A61K39/395(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表7页附图4页(54)发明名称嵌合抗ROR1抗体Fab分子及其制备方法和应用(57)摘要嵌合抗ROR1抗体Fab分子及其制备方法和应用，包括通过链间二硫键连接的重组轻链L和重组重链Fd，所述重组轻链L的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重组重链Fd的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明大大降低了抗ROR1抗体的鼠源性成分，仍保存人鼠交叉反应的特点，有利于进一步开展体内试验。保留了鼠源性抗体的模拟抗原特性，可潜在用于高表达ROR1的肿瘤的靶向诊疗。原核表达载体易于构建，可大量表达，生产快速且便于纯化。有利于制备嵌合全分子抗体或抗体的人源化改造，进一步降低抗ROR1抗体中的鼠源成分，以开展高表达ROR1的肿瘤的靶向诊疗研究。CN107827984ACN107827984A权利要求书1/1页1.嵌合抗ROR1抗体Fab分子，其特征在于包括通过链间二硫键连接的重组轻链L和重组重链Fd，所述重组轻链L的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重组重链Fd的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述嵌合抗ROR1抗体Fab分子，其特征在于编码重组轻链L的核酸序列如SEQIDNO.3所示，编码重组重链Fd的核酸序列如SEQIDNO.4所示。3.权利要求1或2所述嵌合抗ROR1抗体Fab分子的制备方法，其特征在于将鼠源性单克隆抗体的重链可变区VH、轻链可变区VL通过重叠延伸PCR技术分别和人IgG1抗体的重链恒定区CH1和轻链恒定区CL片段连接，获得重组轻链L和重组重链Fd；经过限制性核酸内切酶酶切，L和Fd与表达载体pETDUET-1连接，构建得到嵌合Fab片段的原核表达载体pETDuet-ROR1-cFab；将表达载体pETDuet-ROR1-cFab转入大肠杆菌BL21后加入IPTG诱导表达嵌合的Fab抗体片段，该嵌合Fab抗体的重组重链Fd和重组轻链L通过链间二硫键连接组成抗ROR1抗体人鼠嵌合Fab分子。4.权利要求1或2所述嵌合抗ROR1抗体Fab分子在制备诊疗高表达ROR1的肿瘤药物中的应用。5.一种诊疗高表达ROR1的肿瘤药物，其特征在于有效成分为权利要求1或2所述嵌合抗ROR1抗体Fab分子。2CN107827984A说明书1/7页嵌合抗ROR1抗体Fab分子及其制备方法和应用技术领域：[0001]本发明属于基因工程技术和免疫靶向诊疗领域，具体涉及一种嵌合抗ROR1抗体Fab分子及其制备方法和应用。背景技术：[0002]自1986年美国FDA首次批准单克隆抗体药物—莫罗单抗(Muromomab-CD3)应用于临床治疗以来，已有数十种靶向制剂用于肿瘤治疗，均展现出良好的肿瘤特异性和低毒性，成为肿瘤生物治疗的一大亮点。靶向治疗具有较好的选择性，通过抗体对靶分子的识别，可特异性结合肿瘤细胞膜受体，阻断信号传递过程，进而抑制肿瘤细胞的生长和扩散。近年来，抗体介导的肿瘤靶向治疗技术已在大肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的临床治疗中取得了令人瞩目的成就。然而在卵巢癌领域，大多数单抗介导的靶向治疗还处于临床前试验阶段，尽管针对肿瘤血管生成的单克隆抗体(Bevacizumab等)已用于卵巢癌的治疗，但由于组织特异性差，会在不同程度上与正常组织结合，而其所针对的靶分子在卵巢癌组织中的平均表达量和表达率较低，故临床治疗应用前景不明。因此，积极寻找卵巢癌组织中合适的靶分子已成为妇科肿瘤防治的当务之急。[0003]多项研究表明ROR1在慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、神经母细胞瘤、肾癌等多种肿瘤细胞中过表达，本课题组的前期研究中分析了ROR1与卵巢癌之间的关系，结果发现：①组织芯片技术检测结果显示，卵巢癌组织中ROR1表达的阳性率高达55％，而正常卵巢组织中仅为6％；②定量PCR结果表明不同组织类型的卵巢癌组织中ROR1的表达水平显著高于正常卵巢组织；③ROR1主要存在于卵巢癌细胞胞膜，少部分见于胞核；④ROR1的表达水平与卵巢癌的FIGO分期及预后密切相关，可作为卵巢癌预后的一个独立