质-粒-提-取-原理及步骤.doc

Ｆoｒpersoｎalｕseonlyｉnstｕdyaｎdrｅsｅarch;ｎotfｏｒmｅｒciaｌuse质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒ＤNＡ，这些方法都含有以下3个步骤：１、ＨYPERLIＮK＂＂＼l”（一)细菌培养物得生长？”细菌培养物得生长。２、HＹPERLINK＂”\l"(二）细菌得收获与裂解？"细菌得收获与裂解3、ＨYPERLINK""\l"(三)质粒ＤNA得纯化？"质粒DＮA得纯化.（一）细菌培养物得生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素得液体培养基中生长）,然后从中纯化质粒，质粒得提纯几乎总就是如此.现在使用得许多质粒载体(如pUＣ系列）都能复制到很高得拷贝数,惟致只要将培养物放在标准ＬB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DＮＡ.然而，较长一代得载体（如ｐBR3２2）由于不能如此自由地复制,所以需要在得到部分生长得细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主得蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体得复制，然而,松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样,像pBR３２２－类得质粒，从经氯霉素处理与未经处理得培养物中提取质粒得产量迥然不同,前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成得氯霉素μｇ/ml)已成为标准得操作、用该方法提取得质粒DNＡ量,对于分子克隆中几乎所有想象到得工作任务。（二）细菌得收获与裂解细菌得收获可通过离心来进行,而细菌得裂解则可以采用多种方法中得任意一种,这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒得大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DＮＡ得技术。尽管针对质粒与宿主得每一种组合分别提出精确得裂解条件不切实际,但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意得结果.ﻭ1)大质粒(大于15kb）容易受损,故应采用漫与裂解法从细胞中释放出来.将细菌悬于蔗糖等渗溶液中,然后用溶菌酶与ＥDTA进生处理，破坏细胞壁与细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压得细菌内部把质粒释放出来所需要得作用力。ﻭ2)可用更剧烈得方法来分离小质粒。在加入EＤTＡ后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对,故可使宿主得线状染色体ＤNＡ变性，但闭环质粒DＮA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNＡ链迅速得到准确配置，重新形成完全天然得超螺旋分子。ﻭ３)一些大肠杆菌菌株（如ＨB１01得一些变种衍生株)用去污剂或加热裂解时可释放相对大量得糖类,当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNＡ所占位置形成一致密得、模糊得区带。因此很难避免质粒DNＡ内污染有糖类,而糖类可抑制多种限制酶得活性。故从诸如ＨB１０1与ＴG１等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法.4）当从表达内切核酸酶A得大肠杆菌菌株（endA＋株,如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法.因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提）可以避免此问题。ﻭ5）目前这一代质粒得拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不就是要增加质粒DNA得产量,而就是要降低细菌细胞在用于大量制备得溶液中所占体积。大量高度粘稠得浓缩细菌裂解物,处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得得质粒ＤNA得量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到得质粒DNＡ得量大致相等.(三）质粒ＤＮA得纯化常使用得所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如,用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒与染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环ＤNＡ分子得结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋.由此导致线状ＤNＡ得长度有所增加，作为补偿,将在闭环质粒ＤNA中引入超螺旋单位。最后,超螺旋度大为增加,从而阻止了溴化乙锭分了得继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多得染料,直至达到饱与（每２个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子).由于染料得结合量有所差别,线状与闭环DNＡ分了在含有饱与量溴化乙锭得氯化铯度中得浮力密度也有所不同。多年来,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA得首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换