基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115852042A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202210831910.9A61P31/14(2006.01)(22)申请日2022.07.15A01K67/02(2006.01)C12R1/93(2006.01)(71)申请人中国农业大学地址100083北京市海淀区清华东路17号(72)发明人韩军王晨王迪李劼杨汉春盖新娜周磊张永宁郭鑫高鹏(74)专利代理机构北京兴智翔达知识产权代理有限公司11768专利代理师郭卫芹(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6841(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)A61K39/225(2006.01)权利要求书2页说明书25页序列表（电子公布）附图10页(54)发明名称基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用(57)摘要本发明公开了基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用，通过构建并拯救PEDV嵌合病毒CHM2013‑SPBJ、CHM2013‑SBJ、CHM2013‑SPBJ‑ORF3CHM、CHM2013‑SPBJ‑ECHM、CHM2013‑SPBJ‑MCHM、CHM2013‑SPBJ‑NCHM和CHM2013‑(S+ORF3)BJ，进行功能丧失性试验和功能获得性试验，得到致弱嵌合病毒CHM2013‑SPBJ‑ORF3CHM和CHM2013‑SPBJ‑MCHM，揭示了PEDV变异株BJ2011CS基因协同ORF3、E和M基因促进病毒致病，其中ORF3基因最关键。CN115852042ACN115852042A权利要求书1/2页1.一种基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、首先以CHM2013为骨架，构建和拯救分别置换BJ2011C结构蛋白编码区和S蛋白的嵌合病毒CHM2013‑SPBJ和CHM2013‑SBJ；再以CHM2013‑SPBJ为骨架，构建和拯救分别置换CHM2013结构蛋白的嵌合病毒CHM2013‑SPBJ‑ORF3CHM、CHM2013‑SPBJ‑ECHM、CHM2013‑SPBJ‑MCHM和CHM2013‑SPBJ‑NCHM，进行功能丧失性试验，探究PEDV变异株BJ2011CS蛋白和其它结构蛋白协同促进致病的分子基础；5S2、以2日龄SPF仔猪为模型，口服5×10TCID50的嵌合病毒CHM2013‑SPBJ、CHM2013‑SPBJ‑ORF3CHM、CHM2013‑SPBJ‑ECHM、CHM2013‑SPBJ‑MCHM和CHM2013‑SPBJ‑NCHM进行功能丧失性试验，通过临床情况、每日排毒情况、肠道病理变化和肠道定殖情况分析嵌合病毒对仔猪的致病性，结果显示，与CHM2013‑SPBJ相比，CHM2013‑SPBJ‑NCHM致病性没有减轻；CHM2013‑SPBJ‑MCHM和CHM2013‑SPBJ‑ECHM的致病性有所降低；CHM2013‑SPBJ‑ORF3CHM丧失了致病性；得到PEDV变异株S基因协同结构蛋白ORF3、E和M促进病毒致病，其中S基因协同ORF3促进致病最关键；S3、根据功能丧失性试验结果，以CHM2013‑SBJ为骨架，构建和拯救置换BJ2011CORF3的嵌合病毒CHM2013‑(S+ORF3)BJ，进行功能获得性试验，进一步探究S蛋白和ORF3协同促进致病的分子基础；5S4、以2日龄SPF仔猪为模型，口服5×10TCID50的嵌合病毒CHM2013‑SBJ和CHM2013‑(S+ORF3)BJ，通过临床情况、每日排毒情况、肠道病理变化和肠道定殖情况分析嵌合病毒对仔猪的致病性，进一步确定高毒力毒株BJ2011CS基因和结构蛋白ORF3是否协同促进病毒致病，结果显示，CHM2013‑(S+ORF3)BJ的致病性高于CHM2013‑SBJ，得到PEDV变异株BJ2011CS基因协同结构蛋白ORF3促进病毒致病。2.如权利要求1所述的基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法，其特征在于，还包括：S5、仔猪攻毒后，每日记录仔猪的存活情况，分别于仔猪攻毒前、仔猪死亡时和动物实验结束时称量仔猪体重并记录，仔细观察根据评分标准对仔猪腹泻程度和精神状态进行记录并评分，通过比较存活曲线、平均增重、临床评分和腹泻评分结果；在功能丧失性试验中与CHM2013‑SPBJ相比，CHM2013‑SPBJ‑NCHM具有致死性和致病性，CHM2013‑SPBJ‑MCHM和CHM2013‑SPBJ‑ECHM致病性有所降低，感染仔猪出现腹泻症状，CHM2013‑SPBJ‑ORF3CHM丧失了致病性，感染仔猪临床症状表现为正常；在