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干扰素制备的工艺流程什么是干扰素? α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型 其区别在于个别氨基酸的差异上,早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的,产量低、价格昂贵,不能满足需要,现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。 目的基因的分离一、目的基因的分离与获得二、目的基因与克隆载体进行体外重组三、重组体引入宿主细胞四、从大肠杆菌k12获取目的基因五、提取重组质粒2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)按步骤1)所述方法离心,以收集细菌细胞。 3、碱裂解法1)将冼过的500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml(18ml)溶液I中。溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液I可成批配制,在10lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时,溶菌酶不能有效工作。3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。 4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml 所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物 5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧,可以5000转/分再度离心20分钟,然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分6)上清过滤至一250ml离心瓶中,加0.6体积的异丙醇,充分混匀,于室温放置10分钟。 7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟,回收核酸。如于4℃离心,盐也会了生沉淀。 8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇,用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 10)纯化。 六、质粒DNA的纯化5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/LNaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。6)吸出上清,用400μlTE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。8)吸去上清,加200μl处于4℃以12000g离心2分钟。9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)]后测量OD260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml),然后将DNA贮于-20℃。七、对重组质粒的检测与目的基因提取八、目的基因与表达载体的组合与导入干扰素的发酵工艺过程1.菌种制备取-70℃下保存的甘油管菌种(工作种子批),于室温下融化。然后,接入摇瓶,培养温度30℃,pH7.0,250r/min活化培养18±2小时后,进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 2.种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中,接种量10%,培养温度30℃,pH7.0,级联调节通气量和搅拌转速,控制溶解氧为30%,培养3~4小时,转入发酵罐中,同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查,控制杂菌 3.发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中,接种量10%,培养温度30℃,pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速,控制溶解氧30%,培养4小时。然后控制培养温度20℃,pH6.0,溶解氧60%,继续培养5~6.5小时。同时进行发酵液杂菌检查,当OD值达9.0±1.0后,用5℃冷却水快速降温至15℃以下,以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中,加入冰块使温度迅速

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