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CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项

一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理

CellCountingKit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖

和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲

氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，

它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的

作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物

（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此

可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

CCK8的优点：
•使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
•CCK-8法能快速检测；
•CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；
•CCK-8法的重复性优于MTT法；
•CCK-8法对细胞毒性小；
•CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

CCK8的缺点：
•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
•CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意
的话容易产生漏加或多加。

与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：

检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法

甲臢产物的水差（需加有机好好好
溶性溶剂溶解）

产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液

使用方法配成溶液后现配现用即开即用即开即用
使用

检测灵敏度高很高很高高

检测时间较长较短较短最短

检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm

细胞毒性高，细胞形态很低，细胞形很低，细胞形很低，细胞形
完全消失态不变态不变态不变

试剂稳定性一般较差一般很好

批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合

便捷程度一般便捷便捷非常便捷

二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法
实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，
同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果
不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在
孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或
者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如
果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形
成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，
参比波长600-650nm。

实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，
同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果
不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质
5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性
质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时
间。
6、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在
孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如
果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形
成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，
参比波长600-650nm。

注：

•若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液
或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
24小时内测定，吸光度不会发生变化。
•如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新
鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新
的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可
以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项

•当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/
孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐
接种量不低于2,500个/孔(100μl培养