进出口化妆品眼刺激性试验--体外中性红吸收法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

犛犖／犜３０８４．１—２０１２

进出口化妆品眼刺激性试验
体外中性红吸收法

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２０１２０５０７发布２０１２１１１６实施

中华人民共和国发布
国家质量监督检验检疫总局

书

犛犖／犜３０８４．１—２０１２

前言

本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检
疫局。
本部分主要起草人：史喜菊、马贵平、曾静、程树军、李冰玲、李炎鑫、刘全国、刘旭辉。

Ⅰ

书

犛犖／犜３０８４．１—２０１２

进出口化妆品眼刺激性试验
体外中性红吸收法

１范围

本部分规定了用体外中性红吸收法检测化妆品眼刺激性潜力的操作方法。
本部分适用于可溶性表面活性剂和以表面活性剂为基础的化妆品原料及配方产品。
本部分适用于眼刺激性较弱的产品测试，对于难溶、易挥发、有色和对溶酶体有反应的物质不适用。
本部分是化妆品眼刺激性潜力的预筛选试验，可作为体外眼刺激试验组合方法或系列方法的一部
分，对化妆品的眼刺激性进行最终分类。

２规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法
ＳＮ／Ｔ２２８５化妆品体外替代试验实验

３术语、定义和缩略语

３．１术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

３．１．１细胞成活力

细胞群体总活性的度量参数，在此以５４０ｎｍ处的光吸收值（ＯＤ５４０ｎｍ）表示。

３．１．２相对细胞成活力

被试物质细胞成活力与阴性对照细胞成活力的比值，在此以５４０ｎｍ处的相对光吸收值

（ＯＤ５４０ｎｍ％）表示。

３．２缩略语

下列缩略语适用于本文件。
ＤＭＥＭ：细胞培养液。
ＮＲＵ：中性红。
ＤＭＳＯ：二甲基亚砜。
ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液（细胞洗涤液）。
ＳＤＳ：十二烷基磺酸钠。

ＩＣ５０：能使ＢＡＬＢ／ｃ细胞对中性红的吸附能力减少５０％的被试物质的浓度。
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４方法原理

化妆品的眼刺激性是评价化妆品卫生质量的一项重要毒理学指标，通常情况下，对眼睛有损害的物
质也可以产生细胞毒性效果，因此可通过测试细胞毒性大小反映受试物的眼刺激性。中性红是细胞活
力标记物，可以被活细胞吸附并在细胞溶酶体中积蓄，当细胞表面或溶酶体膜改变时，导致中性红吸附
减少。死细胞不能积蓄中性红，故不被染色。因此，化妆品体外眼刺激性试验中性红吸收法（Ｎｅｕｔｒａｌ
ＲｅｄＵｐｔａｋｅＡｓｓａｙｓ，ＮＲＵ）是通过检测化妆品对小鼠成纤维细胞（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３）吸附中性红能力的抑
制效果，由此反映受试物对细胞膜结构、细胞器功能、物质和能量代谢以及由此导致的细胞增殖和存活
力的影响，据此推测其眼刺激性强度。在该试验中，ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞先与受试物孵育，再加入中性红
染料继续孵育，加入中性红解除物质溶解细胞中的结晶物终止反应，在波长５４０ｎｍ测定其吸光度值

（ＯＤ５４０ｎｍ），由浓度反应曲线测得吸光度降低５０％的受试物浓度，即ＩＣ５０作为毒理学评价指标。

５设备

５．１ＣＯ２培养箱（３７℃±０．５℃，５％～７．５％ＣＯ２）。
５．２恒温水浴箱（３７℃±０．５℃）。
５．３酶标仪。
５．４振荡器。
５．５超纯水仪。
５．６超净工作台（无菌操作）。
５．７倒置显微镜。
５．８全自动血球计数仪。
５．９微量可调移液器（２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）及相应的吸头。

６试剂和材料

６．１试验用细胞

本部分推荐使用小鼠成纤维细胞系ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３，ＣｌｏｎｅＡ３１［来源于美国培养物保藏中心
（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）或欧洲细胞培养物保存中心（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＥＣＡＣＣ）］。应该定期检查细胞是否被支原体污染，尽可能使用传代次数最低的ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３

细胞系，通常要小于１００代。培养的适宜条件为３７．５℃、７．５％ＣＯ２的湿环境下温育。

６．２细胞洗涤液

配制见Ａ．１。

６．３细胞培养液

配制见Ａ．２。

６．４处理培养液

配制见Ａ．３。
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６．５中性红培养液

配制见Ａ．８。

６．６中性红解除物

配制见