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uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的研究任务书
一、研究背景
转移生长因子-α（TGF-α）是一种促进肿瘤生长的细胞因子，其作用机制是通过结合表皮生长因子受体（EGFR）来激活信号通路。同时，癌细胞中的泛素化调节因子Nrdp1和钙调蛋白CAY1也能够调控EGFR的稳定性和活性。此外，参与肿瘤细胞侵袭与转移的组蛋白去乙酰化酶HDAC6也能调控EGFR的稳定状态和活性。因此，EGFR/TGF-α信号通路是肿瘤生长、转移以及治疗抵抗的重要作用机制。
脑内皮质素A（NRP1）和NRP2是EGFR和VEGFR2的共受体。两者都能结合多种生物活性分子，如VEGF、TGF-β1、TGF-α、GP96、HB-EGF等分子。NRP1和NRP2的功能依赖于细胞和组织的类型。在EGFR的信号传导中，NRP1作为钙调素连接蛋白（CAML）的调节因子参与其活性和社会信任的调节。
攻击性肿瘤（如乳腺癌等）细胞中，NRP1被表达，也与EGFR表达的细胞共同出现。颈动脉肿瘤细胞中，NRP1通过IGF-I信号通路增强了EGFR的自发活性，并通过NRP1介导EGFR的乙酰化、泛素化、废弃和降解的废弃通路。NRP1调节EGFR信号通路的能力表明，对其作用机制的探究将开辟一条新的肿瘤治疗途径。
uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的研究是肿瘤生长和转移机理研究的一个方向，它强调uPA在在肿瘤的疾病病理生理中具有的现代生命学特点。通过TEM8诱导EGFR磷酸化，可以更好地了解攻击性肿瘤生长的机理，并为临床肿瘤治疗提供新的理论和实验基础。
二、研究目的
本次研究项目旨在探究uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的机制，进一步了解肿瘤的生长和转移机理，并为肿瘤治疗提供理论和实验基础。
三、研究内容与方法
3.1研究内容
1.分离、培养、鉴定乳腺癌组织中的uPA和EGFR表达的细胞系。
2.建立小鼠肝细胞膜TEM8过度表达模型。
3.筛选uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的细胞系，确定趋势最大的细胞系。
4.探讨uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的内在机制，包括蛋白质修饰、多肽结构、信号转导等因素。
5.筛选和筛选uPA、NRP1、TGF-α、HDAC6和Nrdp1在uPA-TEM8-EGFR信号通路中的关键因子。
6.结合小鼠模型探讨uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化在体内的作用机制。
3.2研究方法
1.分离、培养、鉴定乳腺肿瘤组织中的uPA和EGFR表达的细胞系。
（1）分离肿瘤组织细胞：采用组织酶消化（如胰酶、胶原酶等）和筛选培养法（如贴壁培养、半悬浮培养等）对配对的肿瘤组织进行筛选，得到表达uPA和EGFR的细胞系。
（2）免疫荧光：借助荧光显微镜观察细胞的蛋白表达情况，进一步确定细胞系的鉴定结果。
2.建立小鼠肝细胞膜TEM8过度表达模型。
使用重组质粒pLenti4-TEM8-IRES-EGFP将TEM8全长基因转染小鼠肝癌细胞系中，使用荧光显微镜观察转染效果。
3.筛选uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的细胞系
将小鼠肝癌细胞系分别重组TEM8、uPA和EGFR，通过分析细胞系中EGFRTyr1173磷酸化水平的变化，确定若干个转染建模的小鼠肝癌细胞系，锁定趋势最大的细胞系，用于后续工作的采用。
4.探讨uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的内在机制
（1）蛋白质修饰：转染慢病毒强表达uPA、EGFR、TEM8、NRP1之后，分别以不同的蛋白质修饰抑制剂处理细胞，如磷酸酰胺抑制剂、甲基化抑制剂等，分别以西方印迹法测定蛋白质的磷酸化、甲基化水平的变化，以确定蛋白质修饰对uPAthroughTEM8诱导EGFR磷酸化的影响。
（2）多肽结构：将TEM8取代成拥有类似大肠杆菌分泌郑单元的人类FGF7作为占位子，并将其与EGFR、uPA和NRP1共转染，通过西方印迹法和ELISA法探讨FGF7参与的uPAthroughTEM8诱导EGFR磷酸化的可能机制。
（3）信号转导：转染抑制EGFR和NRP1的siRNA，采用蛋白质印迹法、共沉淀法等方法检测uPAthroughTEM8诱导EGFR磷酸化在EGFR和NRP1信号通路中的作用。
5.筛选和筛选uPA、NRP1、TGF-α、HDAC6和Nrdp1在uPA-TEM8-EGFR信号通路中的关键因子。
通过上述实验的结果，对uPA-TEM8-EGFR信号通路中的关键基因进行筛选。
6.结合小鼠模型探讨uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化在体内的作用机制。
比较小鼠加入uPA-TEM8和NC的情况下EGF、ERK和AKT信号通路磷酸化水平的变化，探讨uPAthroughTEM8诱导EGFR磷酸化在肿瘤生长和转移过程中的作用机制。
四、研究意义
uPA通过TEM8诱导EGFR磷酸化的研究有助于探索肿瘤生长和转移的机理