MSCs的分离培养鉴定及MSCs-si NRSF的构建和检测.docx

MSCs的分离培养鉴定及MSCs-siNRSF的构建和检测
MSCs的分离、培养和鉴定
MSCs（mesenchymalstemcells）是一类多能干细胞，具有自我更新、增殖、分化成多种细胞类型的能力。这些细胞类别在体内发挥重要作用，因此，从体外分离这些细胞对于研究和治疗等方面具有重要意义。
MSCs从骨髓、脐带血、脂肪和牙髓等多种来源分离。骨髓也是分离MSCs最常用的来源，分离MSCs的方法可以利用负向选择法或是黏附法等。负选择法主要利用骨髓单个核细胞的缺点，通过抗体吸附和磁珠分离，获取未缺失MSCs的群体，该方法得到的细胞数量小且洁净。而黏附法则利用细胞的粘附特性，将细胞在培养皿中黏附下来，非MSCs在培养过程中逐渐被清除，最终获得纯化的MSCs。这种方法适应范围广，制备简便，效果也较好。但是，黏附法取用的饵料和滤器都很昂贵。无论是哪种方法，提纯得到后，就需要对MSCs进行培养和鉴定。
在鉴定MSCs的时候，通常需要对其进行多种指标的检测，即：对多能性的检测、表面标记检测以及细胞的生长和增殖检测。对于多能性的检测，实验室通常使用免疫荧光法或免疫静电计量法等。多能性的检测可以确定MSCs的增殖和分化特性。MSCs的表面标记检测通常会通过对表面标记的抗体染色间接确定MSCs表面的蛋白质应有的标记化合物的存在。细胞的生长和增殖检测则通过监控群体生长曲线的变化，以及判断其误差范围等来确定MSCs的生长和增殖状态。这些检测的结论需要密切观察，以便进一步分析MSCs的基因表达、分化能力等等相关能力。
MSCs-siNRSF的构建和检测
前面提到了MSCs具有多种分化能力。而NRSF（neuralrestrictivesilencerfactor）是一种核转录因子，具有细胞分化抑制能力，对于MSCs分化成为神经系统细胞来说，其需要被抑制。对NRSF的抑制能够促进MSCs转化为神经系统细胞，因此，要构建MSCs-siNRSF靶向基因干扰工具，有助于进一步了解MSCs的分化过程。
在构建MSCs-siNRSF之前，需要在生物信息学数据库中查询到对应的靶向序列，然后利用CRISPR/CAS9等技术来敲除或者靶向抑制该基因的表达。建立了MSCs-siNRSF之后，可以利用基因表达技术或营养鉴定法等方法检测MSCs-siNRSF是否成功构建。其中，基因表达技术可以检测到NRSF目的基因的sgRNA是否成功，以及NRSF的表达量。营养鉴定法则用贴士含量来衡量MSCs的饱和度和细胞数量。
通过构建MSCs-siNRSF可以促进MSCs向神经元细胞分化，可能是地道的神经元细胞来源之一。这将有助于理解神经系统分化过程以及神经退行性疾病的甚至神经损伤的治疗。