动物细胞培养的基本方法教程文件.ppt

第五节动物细胞培养的基本方法2消化分离法二细胞计数三细胞传代2贴壁细胞的传代已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次。
2倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。
分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以20～30万个/ml,每次1传2或1传3。
传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天就要传代一次。四细胞的冻存和复苏2细胞的复苏第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式动物细胞大规模培养：
在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖)等。已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
依细胞种类：原代培养、传代培养
依培养基：液体培养、固体培养
依培养器和方式:静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。
生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。
一、动物细胞大规模培养的方法缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。2、贴壁培养优点：
a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。缺点：
a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积。
b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。
c不能有效地监控细胞的生长。
贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载体培养。
贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。
3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养理想的微载体应具备：
生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当（1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在60-250m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原料充分。
80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，增大了供细胞贴附的比表面积。
应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原②包埋或微囊培养：
将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。
可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。
包埋法：
将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。
优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切。包埋法微囊法：
用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜。
囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。③结团培养：
利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。二、动物细胞培养的操作方式另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。2、半连续式操作该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
3、灌流式操作第六节动物细胞生物反应器一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构机械搅拌式生物反应器（1）罐体的高径比一般采用1-1.5：1，利于增大与空气的接触面
（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20-100r/min
（3）采用无气泡通气系统，防止气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤
（4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。气升式生物反应器与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在10：1左右。
中空纤维反应器由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50-100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。
①不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测。膜式生物反应器在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析