实验细菌转化.ppt

一、实验目的二、实验原理四、实验用具和药品LB培养基配方：实验药品五、实验步骤（二）菌体收集
实验当天：
将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心2min；
弃上清（三）碱裂解法提取质粒DNA
全套操作约需1小时，详细说明如下。
3.加入250μl的SolutionⅠ（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。
注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
注）此步骤不宜超过5分钟。
5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。

6.室温12,000rpm离心10分钟，取上清。
注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。

7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。
8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。9.将500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
10.将700μl的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11.重复操作步骤10。
12.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。
13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。
注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率
14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。六、实验作业实验二大肠杆菌的遗传转化一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、实验用品0.1MCaCl2溶液配制：
称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。
质粒的提取：
利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。五、实验步骤3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mLLB的200mL三角瓶中，37℃，振荡（200r/min）培养2~3h，每隔0.5h测OD600值；
4、当OD600=0.3~0.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置10~60min；
5、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；
6、冰预冷的0.1mol/LCaCl210mL悬浮细胞；
7、冰上放置15min；
8、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；
9、冰预冷的0.1mol/LCaCl22mL悬浮细胞；
10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70℃保存。（二）转化（冰上操作）
1、1.5mL管中加入感受态细胞50μL和待转化的质粒2μL，冰浴30min；
2、42℃热击90sec（勿晃动管子）；
3、冰浴2min；
4、加入37℃预热的LB至1mL；
5、37℃，振荡（<50r/min）培养2h；
6、取200μL涂板（Ampr），37℃培养12-16h；
7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。六、实验作业准备工作