紫外可见分光光度法第2章讲义教材.ppt

紫外可见分光光度法紫外—可见分光光度法(UV-VIS)操作简便、快速、准确度较高，同时由于仪器价格相对较低，因此在体内药物分析中应用广泛。
但由于该方法不具备分离能力，使得其专属性在体内药物的测定中受到一些影响，但如能配合适当的分离手段，如溶剂提取或层析分离，或采用一些特殊的分离测试手段．仍可以使专属性得到大大改善。因此当体内药物浓度达到比μg／ml水平且能采取正确、合理的分离手段时，分光光度法仍然是一个可行的、较好的测定方法。原理：常用样本处理方法：计算分光光度法举例：双波长紫外分光光度法测定氨茶碱血药浓度
取空白血清及含茶碱15μg／m1的血清各0.5ml,按样品处理方法操作,提取液在分光光度计上扫描得各自的图谱,从图谱上看出,在274nm处,茶碱有最大吸收,空白血清提取液也有吸收,对测定结果有干扰。经测定空白血清在274nm与298nm处的吸收基本相等,同时A=A274-A298与血清中茶碱有良好的线性关系,因此用双波长紫外分光光度法测定血中茶碱浓度,可消除空白血清的干扰。导数光谱法：
所谓导数光谱是吸收度关于波长λ的一阶或多阶微分对波长的函数。
为了与经典的紫外分光光度法区别，我们把以吸收度为横坐标．波长为纵坐标作图得到的光谱称为零阶光谱，把以吸收度的变化(dA)对波长变化(dλ)的变化率(dA／dλ)对波长λ作图得到的图谱称为一阶导数光谱，以此类推可得到更高阶数的导数光谱。随着导数阶数的增高，峰的个数也增多，而且峰形更尖锐，原函数上的一些特征，如极值点(峰或谷)、拐点等在各阶导数图像上都有相对应的更明确的显示，因此导数光谱可以提高分辨能力。差示分光光度法：
差示分光光度法消除干扰是基于利用化学反应或改变溶液pH值，选择性的使被测药物的吸收光谱发生改变，而干扰物质不受化学反应或溶液的pH值改变的影响，吸收光谱保持不变。这样当样品池与参比池装有同样浓度的被测样品溶液时，干扰物的吸收差值总是零，因此测得的△A值只与被测物浓度成正比。荧光分光光度法
原理：
药物及代谢物在光照射下吸收紫外光或可见光的能量，使外层电子由基态跃迁到较高能级的激发态。当处于激发态的电子又回到基态时，可将这部分能量以光子形式发射出而产生荧光。产生的荧光其能量比吸收光的能量小一些．因此荧光的波长比照射光的波长要较长一些。

产生机理有：
药物分子直接与斥电子基团(一OH，一NH2或一OCH3)联接有利于荧光的发生，而与吸电子基团(一NO2，一Br．一I，一CN或一COOH)联接则使荧光减弱。
药物具有可电离的基团联接在共轭系统上，则pH值的选择将影响测定的灵敏度和选择性。如酚类电离成酚盐阴离子，使荧光增强；而芳胺成为芳香铵阳离子可抑制荧光发生。药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也有所不同。利用这个待性，可以定性鉴别药物。
同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长的光，则可发射出相同波长的荧光。若该药物及代谢物的浓度越大，则发射的荧光强度越强。利用这个性质，则可进行体液中药物浓度的定量测定。
荧光法的优点：测定灵敏度高，一般紫外—可见分光光度法的灵敏度在10-7g／m1，而荧光分光光度法的灵敏度可达10-12g／ml。虽然能发荧光的物质数量不多，但许多重要的生化物质、药物及其代谢物或致癌物质都有荧光现象。由于荧光衍生化试剂的使用进一步扩大了荧光法的应用范围，因此该法在体内药物分析利药物动力学研究中得到广泛地应用。

基本原理：荧光法的定量方法
标准曲线法：用已知量的标准物质经过和供试品进行相同的处理之后，配成一系列浓度不问的标准溶液．在测定条件相同的情况下．分别测定其荧光强度。以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。然后在相同条件下测定样品溶液的荧光强度，就可从标准曲线上求出样品溶液的浓度。如果要求精确测定时．可用回归直线方程计算样品溶液的浓度。对照法：如果荧光的标准曲线通过零点，就可选择其线性范围，用对照法进行测定。通常取已知量的纯净荧光物质，配制一标准溶液，使其浓度在线性范围之间，测定荧光强度Fs，然后在相同条件下测定样品溶液的荧光强度Fx。由标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度比较，求得样品中荧光物质的含量。在空白溶液的荧光强度调不到0％时，必须从Fs与Fx值中扣除空白溶液的荧光强度Fo，然后按下式计算：

式中，Cx为样品溶液的浓度；Cs为标准品溶液的浓度。荧光分光光度法在体内药物分析中的应用：
用荧光分光光度法测量冠心病患者血浆谷胱甘肽
喂饲补阳还五汤大鼠血清中黄芪甲甙的固相萃取-化学衍生化-荧光分光光度法测
仪器：荧光分光光度计
准确移取０.３mg·ml-1的黄芪甲甙对照品溶液０.０５ml于5ml干燥容量瓶中,加入2%茴香酸乙醇溶液0.6ml,再加入72%硫酸溶液0.8ml,摇匀,置于60℃