蛋白质的共价结构讲义教材.ppt

第四章
蛋白质的共价结构主要内容（一）蛋白质的化学组成蛋白质的分类（二）蛋白质的大小蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。一般规定最小的蛋白质是胰岛素，相对分子量为5.7K。
某些蛋白质是由两个或更多个多肽链通过非共价键结合而成的，称寡聚蛋白质。每条多肽链称为亚基或亚单位。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（三）蛋白质结构层次二、肽PEPTIDE4.2肽4.2肽4.2肽4.2肽4.2肽4.2肽4.2肽4.2肽4.2肽三、蛋白质一级结构的测定牛胰腺核糖核酸酶A的一级结构蛋白质一级结构的测定第一步、前期准备第二步、多肽链的数目测定与拆分B.多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。
对于借助非共价键连接在一起的几条多肽链，如，四聚体血红蛋白，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
对于几条多肽链通过二硫键交联在一起的。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
也可应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键
第三步、蛋白质的氨基酸组成分析4.3蛋白质一级结构的测定第四步、分析多肽链的N-末端和C-末端N-端氨基酸测定——DNFB法N-端氨基酸测定——丹磺酰氯法N-端氨基酸测定——PITC法N-端氨基酸测定——氨肽酶法测定路线：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。游离C-端氨基酸可用DNFB法或DNS法并通过层析技术鉴定。
特点：是目前C-末端残基测定的最重要的化学方法，但Gln、Asn、Cys被破坏，C-末端的Arg变成Orn，不能分析。C-末端鉴定——还原法
肽链C-末端AA残基可用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇然后用酸将肽完全水解，用层析法加以鉴定生成的α-氨基醇。Sanger早期用此法鉴定胰岛素A、B链的C-末端氨基酸残基。
C-端氨基酸测定——羧肽酶法Val-Ser-GlyA、多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。1、酶裂解法A、胰蛋白酶（Trypsin）B、糜蛋白酶（Chymotypsin）C、胃蛋白酶2、化学裂解法羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。第六步、分离肽段，测定氨基酸序列A、Edman化学降解法氨基酸序列测定仪测序过程示意图B、质谱法质谱测定的基本步骤——电离多肽分子量的确定选定的多肽在碰撞池中裂解成更小的离子碎片，进入第二台质谱仪进行分析。
裂解主要发生在多肽中连接相继氨基酸的肽键上，因此产生的碎片代表一套大小只差一个氨基酸残基的肽段。第七步、肽段在多肽链中位置的确定示例(十六肽的水解)第八步、确定二硫键位置对角线电泳技术EXERCISE1
一A肽由Lys/His/Asp/2Glu/Ala/Val/Tyr组成；（1）此肽与
FDNB反应得DNP-Asp；（2）此肽用羧肽酶A处理得游离Val；
（3）此肽经胰蛋白酶水解，得二种肽，其中一种（Lys/Asp/
Glu/Ala/Tyr）在pH6.4时净电荷为0；另一种（His/Glu/Val）
可给出DNP-His，在pH6.4时带正电荷；（4）此肽经糜蛋白酶
水解也得二种肽，其中一种（Asp/Ala/Tyr）在pH6.4时呈电中
性，另一种（Lys/His/2Glu/Val）在pH6.4时带正电荷。
试推断此肽的氨基酸顺序。解：a.由（1）知：此肽N-末端为Asp（Asn）；
b.由（2）知：此肽C-末端为Val；
c.由（3）第二种肽知小肽的顺序为：His-Gln-Val；
（此肽的pI=6.4，净电荷=0）
d.由（3）第一肽知此小肽的C-末端为Lys（由胰蛋白酶性质决定），由其净电荷为0可知Asp和Glu仅有一个为酰氨形式，因Lys带正电荷；
e.由（4）第一肽知此小肽的顺序：Asn-Ala-Tyr
（pH6.4时电荷为0知Asn；糜蛋白酶水解知C-Tyr）；
f.由（4）第二肽知此小肽中有一Glu为酰氨形式；且综合b.c.d知此小肽的顺序为：Glu-Lys-His-Gln-Val；
g.综合e和f知此A肽的氨基酸顺序为：
Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val

EXERCISE2
有一缓激肽组成顺序为Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg，试问经（1）羧肽酶B；（2）糜蛋白酶；（3）胰蛋白酶；（4）D