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海口地区猪圆环病毒3型流行株的分离鉴定及遗传变异分析
一、引言
猪圆环病毒3型（Porcinecircovirus3,PCV3）是一种新发现的病毒，属于环状病毒科（Circoviridae）下的猪圆环病毒属（Porcinecircovirus）。PCV3可以引起猪类的多种临床病症，如呼吸系统和胃肠道疾病、生殖和免疫功能障碍等。近年来，PCV3在全球范围内已经被广泛检测到，而且其病毒分布在不同地域、不同品种、不同年龄的猪群中普遍存在。因此，对于PCV3的研究已经成为当前异常重要的课题之一。
海口地区是我国重要的猪肉生产基地之一，但对于该地区PCV3的研究尚不充分。因此，本文拟对海口地区PCV3的分离、鉴定和遗传变异分析进行研究，以期为该地区相关疾病的防控提供科学指导。
二、材料与方法
（一）病毒分离
收集10例猪类呼吸系统和胃肠道疾病症状明显的样品，将其离心后取上清液，用0.22μm滤膜过滤。将滤液接种于PK-15细胞（ATCCCCL-33）中，以DMEM低糖培养基（含10%FBS）为基础培养。在细胞块生成后对细胞上清液进行检测。
（二）病毒鉴定
PCR引物：PCV3-F（5’-CTCGTTAACCGAGCGTGAGA-3’）和PCV3-R（5’-GCCCGGTTTTTTTTTTTCTG-3’）。
扩增条件：初步退火95℃2min，然后进行循环扩增，也就是：
1、94℃40s
2、55℃40s
3、72℃40s
四个阶段循环30次
4、72℃5min
阳性PCR产物经酶切鉴定，鉴定结果为约1300bp的特异性扩增片段，酶切后为约300bp和1000bp。
（三）基因测序和遗传变异分析
对于PCR扩增出的阳性片段，提取其基因组总DNA并进行Sanger测序。利用DNASTARLasergene软件进行遗传变异分析。
三、结果
（一）病毒分离
经过PK-15细胞的筛选，成功分离了2株病毒。
（二）病毒鉴定
对于两株病毒进行PCR扩增，并通过酶切实验鉴定，鉴定结果均为阳性。酶切后片段大小分别为约300bp和1000bp。见附图1所示。
（三）基因测序和遗传变异分析
两株病毒基因组总DNA均经Sanger测序得到，序列长度约为2200bp。使用DNASTARLasergene软件进行遗传变异分析，发现两株病毒的同源性大于99%。
四、讨论和结论
本研究首次成功分离了海口地区的PCV3流行株，并通过PCR扩增和酶切鉴定进一步证实了这是PCV3病毒。通过基因测序和遗传变异分析，我们发现这两株病毒的同源性较高，符合PCV3流行株的特点。这一结果表明，海口地区的猪圆环病毒3型流行情况与其他地区病毒相似，并且对于该地区相关疾病的防控具有重要的参考价值。
然而，本研究的样本量较小，且只针对了病毒的分离和鉴定，还需要进一步深入研究病毒的基础生物学特性、致病机制、传染性和疫苗研发等方面，为有效预防和控制PCV3引起的疾病提供更加科学的理论支持。