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猪流行性腹泻病毒ORF3基因云南株的克隆及序列分析
引言
猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是一种引起猪类肠胃道疾病的病原体，其病毒颗粒为球形，直径约为60-140nm。PEDV在全球育种的母猪中普遍存在，其主要症状为腹泻、呕吐和食欲不振。PEDV会对猪农业生产带来巨大的经济损失，因此了解PEDV的基本生物学特征以及不同地区PEDV的基因序列特征对于预防和控制PEDV流行非常重要。
本文主要介绍了我们对云南地区PEDV的研究，包括基因克隆、序列分析和进化分析。
材料与方法
样品采集及RNA提取
本次研究样品采集于云南地区，由已死亡的猪提取肠道组织，经组织匀浆后，利用TRIzol总RNA提取试剂盒（Invitrogen，美国）提取总RNA，根据说明书步骤操作，用RNase-FreeddH2O溶解提取得到的RNA，测定纯度和浓度，并进行保存。
ORF3基因克隆
采用反转录PCR法将云南PEDV的ORF3基因克隆出来。首先将总RNA反转录成cDNA，cDNA用于模板进行PCR扩增。PCR反应体系：10μL2×SYBRGreenqPCRMix（Takara，日本）、1μL前向引物（5'-TCGGGAACCTTATCCATATGAG-3'）、1μL反向引物（5'-TACCAACTCAGGGTTTACCTTC-3'）、2μLcDNA、6μLRNase-FreeddH2O，总体积为20μL。PCR反应条件：初步退火95℃，30s；复性退火95℃，5s，60℃，30s，共40个周期；最终延伸72℃，10min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用MiniBESTDNAFragmengtPurificationKit（Takara，日本）纯化后进行测序。
序列分析
测序完成后，采用DNAMAN软件（LynnonCorporation，美国）对ORF3基因等位基因进行序列编辑和比对，并建立了云南地区PEDV的ORF3基因等位基因的进化树。
结果
从云南地区采集的猪肠道组织中成功克隆出PEDV的ORF3基因，并进行了测序分析。结果显示该PEDV株的ORF3基因全长为657bp。该ORF3基因全序列已被提交到基因库（GenBank）中，并获得了登记号（MW078625）。
对ORF3基因序列进行分析后，我们发现云南地区PEDV的ORF3基因与其他地区的PEDV存在显著差异。同时，我们还进行了进化分析，发现云南地区PEDV与东南亚PEDV有密切的亲缘关系。
讨论
目前，PEDV在全球范围内被广泛地应用于猪农业生产中。研究表明，PEDV的基因序列具有高度的多样性，不同地区PEDV的基因序列也存在一定的变异性。在本次研究中，我们成功地从云南地区采集的猪肠道组织中克隆了PEDV的ORF3基因，并发现云南地区PEDV的基因序列与其他地区的PEDV存在显著差异。进一步的进化分析也证明了云南地区PEDV具有东南亚PEDV基因序列的亲缘关系。
结论
本次研究成功克隆了来自云南地区的PEDV的ORF3基因，通过序列分析发现云南地区PEDV的基因序列与其他地区PEDV存在差异，并通过进化分析发现云南地区PEDV具有与东南亚PEDV的亲缘关系。这些结果将有助于更好地了解PEDV的基本生物学特征以及不同地区PEDV的基因序列特征，为预防和控制PEDV流行提供了重要的科学依据。